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籽瓜中多糖的提取及其抗氧化活性研究

2024-08-15 99 上传者：管理员

摘要：本文以籽瓜作为实验的主要材料，运用超声波辅助提取法将籽瓜多糖提取出来，通过温度、时间、料液比、功率等单因素实验找出籽瓜多糖最大提取率的工艺参数。对修改后的工艺参数进行检测发现，籽瓜多糖提取率最大值为6.32%；以Vc作对照，对籽瓜多糖进行抗氧化活性分析，结果显示，当籽瓜多糖的浓度达到0.08 mg/mL时，对DPPH自由基和羟自由基的清除能力达到Vc的一半，这表明SMP具有一定的抗氧化活性。

关键词：
利尿
微量元素
抗氧化活性
籽瓜多糖
超声波提取
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籽瓜营养丰富，含人体必需的多种氨基酸、维生素，以及钾、钙、镁等微量元素，具有散热、解渴、利尿等功效。研究发现，内皮、瓜瓤和瓜籽中含有蛋白质和可溶性总糖，利用芬顿法测定籽瓜瓜皮部位多糖的抗氧化活性，结果表明，其提取物对羟自由基和1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基的清除效果较好，因而可以推测出籽瓜具有一定的抗氧化活性[1]。要想充分利用籽瓜中的各种成分，就必须选择适宜的方法提取多糖并进行分离纯化，并对其结构和功能进行详细研究，提高副产物的利用价值[2-4]。利用超声波辅助法提取籽瓜多糖（SMP），不仅反应条件温和、仪器操作简单、节能环保且不会破坏实验对象的生物活性，还可以确保整个实验过程可控。

1、材料与方法

1.1材料与仪器设备

实验材料：新疆籽瓜（市售）、石油醚、无水乙醇、氢氧化钠、硫酸、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚、苯酚。以上所用试剂均为分析纯。试验设备：破壁料理机（E53）、超声波清洗器（PM5-2000TD）、冷冻干燥机（Lab-1）、旋转蒸发仪（EV241）、除湿干燥机（DZF-6050）、高速离心机（CF16RN）、超声仪（KQ-400GKDV）、电子天平（ML204T/02）。

1.2试验方法

1.2.1籽瓜多糖的提取工艺流程

清洗灰尘→去皮去籽→切块→干燥→粉碎→过筛→加入石油醚浸泡→浓缩→烘干→得到籽瓜干粉→加入蒸馏水配制提取液→离心→减压浓缩→醇沉→离心→Sevage法脱去蛋白质→冷冻干燥→籽瓜多糖。

1.2.2实验的操作要点

1）籽瓜干粉制备。挑选新鲜完整的籽瓜，清洗表面的泥土，将籽瓜去皮、去籽后切成大小均等的果块，在30℃下烘干24 h后进行粉碎。使用80目的筛网过滤籽瓜干粉，以干粉∶石油醚=1∶3的料液比（g/mL）将干粉浸泡在石油醚中，于24℃下静置10 h，使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩后放入45℃的干燥箱中烘干，得到籽瓜干粉。2）提取工艺。将5 g的籽瓜干粉置于30 mL的蒸馏水中，用超声仪提取SMP，以5000 r/min离心30 min。利用旋转蒸发仪在50℃下对提取液进行减压浓缩后，加入20 mL的无水乙醇，使上清液醇沉20 h。以5000 r/min再次离心30 min，取下层沉淀物。用无水乙醇、丙酮和乙醚反复洗涤沉淀物3次，除去杂质。将蛋白质类杂质用Sevage法分离出来。3）蛋白质除杂。将4 m L的氯仿溶液与1 mL的正丁醇溶液混合后，加入4 mL的多糖溶液，搅拌40 min后，以2000 r/min离心20 min。离心后取上层清液，加入配制好的氯仿-正丁醇溶液，混合均匀后，以2000 r/min进行第二次离心。重复此操作3次。收集沉淀，在-50℃的条件下冷冻干燥，即可获得SMP。

1.3籽瓜多糖提取的单因素实验

1.3.1温度对SMP提取率的影响

将SMP提取时间调整到2 h，加入料液比（g/mL）为1∶30的提取液，超声波功率参数设置为300 W，判断不同温度（25、30、35、40、45、50℃）对SMP提取率的影响，每个样品平行测定3次。观察SMP提取率的变化趋势并进行单因素分析。

1.3.2时间对SMP提取率的影响

将SMP提取温度控制到40℃，超声波功率参数设置成300W，加入料液比（g/m L）为1∶30的提取液，判断不同时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h）对SMP提取率的影响，每个样品平行测定3次。观察SMP提取率的变化趋势并进行单因素分析。

1.3.3料液比对SMP提取率的影响

将SMP提取时间调整至2 h，提取温度控制到40℃，超声波功率参数设置为300 W，判断不同料液比（g/mL)(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）对SMP提取率的影响，每个样品平行测定3次。观察SMP提取率的折线图走向并进行单因素分析。

1.3.4功率对SMP提取率的影响

将提取时间调整至2 h，温度控制到40℃，加入料液比（g/mL）为1∶30的提取液，判断不同功率（100、200、300、400、500、600 W）对SMP提取率的影响，每个样品平行测定3次。观察SMP提取率的变化趋势并进行单因素分析。

1.4籽瓜多糖提取率测定公式

SMP提取率的测定公式为：

式中，X1为SMP的提取率，%；m1为SMP质量，g;m2为籽瓜干粉质量，g。

1.5籽瓜多糖的抗氧化活性研究

1.5.1 SMP对DPPH自由基清除效果检测

将1 mL质量浓度范围为0.02～2 mg/mL的SMP样品溶液与2 mL甲醇溶液混合后，吸取2 mL DPPH自由基样品溶液，滴入混合溶液中，振荡均匀，在25℃避光环境下静置20 min。测出517 nm处的吸光度值A1（吸光值的变化可以反映出SMP的清除能力）；取1 mL质量浓度范围为0.02～2 mg/mL的SMP样品溶液与1 mL的Vc溶液以及2 mL甲醇溶液混合，测出517 nm处的吸光值A2；将2 mL甲醇溶液与2 mL的DPPH自由基溶液混合，测出517 nm处的吸光值A0作为对照。通过计算DPPH自由基的清除率来比较SMP的抗氧化能力。DPPH自由基清除率公式为：

式中，X2为DPPH自由基清除率，%；A0为无样品DPPH自由基溶液的空白吸光值；A1为待测样品与DPPH自由基混合溶液的吸光值；A2为不加DPPH自由基溶液的样品吸光值。

1.5.2 SMP对羟自由基清除效果检测

羟自由基清除作用检测：向试管中加入多糖溶液与去离子水，配制质量浓度范围为0.02～2 mg/mL的样品溶液。将样品溶液与2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液以及H2O2溶液混合，于25℃避光环境静置10 min，滴入2 mL 6 mmol/L的水杨酸溶液，摇匀后静置30 min，测出517 nm处的吸光度值。Vc用于空白对照。平行测定3次，求平均值。通过计算羟自由基的清除率来比较SMP的抗氧化能力。羟自由基清除率公式为：

式中，X3为羟自由基清除率，%；A3为无样品的混合反应液的吸光值；Ai为待测样与混合反应液的吸光值；Aj为不加水杨酸的样品溶液的吸光值。

2、结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1提取温度对籽瓜多糖提取率的影响

随着温度的升高，SMP提取率显著升高。在25～40℃，提取率随着温度的升高而增大。当温度在40℃时达到顶峰，提取率为5.8%。当温度超过40℃以后，SMP提取率缓慢下降，这是因为多糖不耐高温环境，温度过高会破坏多糖的空间结构，使多糖不易溶出，最终导致SMP提取率下降[5]。因此，SMP的最佳提取温度为40℃。

2.1.2提取时间对籽瓜多糖提取率的影响

在1～2 h内，SMP提取率增长迅速并达到最大值5.8%。当提取时间延长至3.5 h时，提取率明显下降，其原因可能是提取时间太久，会引起多糖结构的改变，或者分子中的碳环断裂，使多糖变成单糖或寡糖，在醇沉期间，单糖与低聚糖会丢失，从而影响提取的效果。因此，SMP的最佳提取时间为2 h。

2.1.3料液比对籽瓜多糖提取率的影响

料液比与SMP提取率整体呈现先增加后减小的趋势。多糖提取率下降的原因可能是在较小的料液比下多糖不能完全溶出，从而降低了提取率。在一定范围内较大的料液比对多糖的溶胀作用更显著，使多糖更容易从组织中释放，进而提高提取率。如果料液比超出适宜范围，后续的提取过程需要更多的时间，导致提取的时间成本增加以及多糖的损失。因此，SMP的最佳提取料液比（g/mL）为1∶30。

2.1.4超声波功率对籽瓜多糖提取率的影响

在100～200 W内，SMP提取率有所提高。当功率扩大至200 W时，SMP提取率达到最大值6.2%。其原因可能是超声波的空化作用得到增强，溶剂更易渗透到溶质内部，短时间内，超声波对细胞的破碎能力增强，从而使多糖物质更易释放[6]。当超声波功率提升至300 W时，多糖提取率逐渐下降，最后趋于平缓。因此，SMP的最佳提取功率为200 W。

2.2抗氧化活性评价

2.2.1对DPPH自由基的清除效果

质量浓度是影响SMP对DPPH自由基清除的重要因素。以Vc作为对照，当SMP的质量浓度在0.02～0.14 mg/mL内，其对DPPH自由基清除能力展现出较强的依赖关系。SMP和Vc的质量浓度在0.06～0.10 mg/mL,DPPH自由基的清除率增长迅速。当SMP质量浓度为0.08 mg/mL时，SMP对DPPH自由基的清除能力达到Vc的一半；当SMP的质量浓度持续增大，SMP对DPPH自由基清除效果趋于平缓，清除率最大可达54%。

2.2.2对羟自由基的清除效果

以Vc作为对照，当SMP的质量浓度在0.02～0.14 mg/mL时，SMP对羟自由基的清除能力与剂量浓度呈现出较强的浓度依赖关系。当SMP的质量浓度在0.04～0.08 mg/mL时，SMP对羟自由基的清除率增长迅速。当SMP的质量浓度达到0.08 mg/mL时，SMP对羟自由基的清除能力达到Vc的一半。随着质量浓度持续增加，清除率上升趋势较平缓，清除率最大可达57%，这表明SMP具有一定的抗氧化活性。

3、结论

随着籽瓜种植面积越来越大，对其进行有效开发与合理利用则具有重要的意义。实验通过响应面分析处理，确定超声波技术萃取SMP的最适工艺参数为：提取温度为40℃、提取时间为2 h、料液比（g/mL）为1∶30、声波功率为200 W。在优化结果的基础上，SMP最大提取率为6.32%。此方法简单高效，提取工艺稳定性高，多糖得率高，而且还不会影响到生物活性。在探究抗氧化性的实验中，利用Vc做对照试验，进行SMP对DPPH自由基和羟自由基的清除效果测试，结果表明，清除率与质量浓度存在一定的剂量效应关系，SMP展现出较高的抗氧化活性。

参考文献:

[1]鲁疆,刘志雯,任丽君,等.打瓜干皮多糖提取工艺及体外抗氧化活性[J].新疆中医药,2019,37(3):47-50.

[2]代彩玲,王萍,李书颉,等.籽用西瓜多糖的分离纯化､一级结构分析及体外生物活性研究[J].果树学报,2020,37(8):1196-1206.

[3]常雪花,钱雅雯,王振菊,等.籽瓜多糖对益生菌生长促进效应及其结构表征[J].食品研究与开发,2022,43(19):68-78.

[4]孟楠,樊振江,高雪丽.纤维素酶法提取黄秋葵多糖的工艺优化[J].食品工程,2017(4):14-17.

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[6]刘强,吴艳,吴金鸿,等.超声波辅助提取胖大海多糖工艺优化[J].食品科学,2012,33(20):99-103.

文章来源:王红.籽瓜中多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].品牌与标准化,2024,(05):20-22.