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原发性肝癌组织中CCDC34表达特点及对肝癌细胞活性的影响

2025-04-10 51 上传者：管理员

摘要：目的探讨原发性肝癌组织中卷曲螺旋结构域(CCDC)34表达特点及对肝癌细胞活性的影响。方法选取行手术治疗的老年原发性肝癌患者95例，收集手术切除的肝癌癌组织和癌旁正常组织，免疫组化法检测CCDC34表达；术后随访3年，记录患者生存情况。体外培养人原发性肝癌细胞株QGY-7703,构建慢病毒稳定上调CCDC34细胞模型，并采用Western印迹检测CCDC34高表达组、阴性对照组、空白对照组细胞中CCDC34蛋白表达水平；CCK-8法检测3组细胞增殖能力，细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测3组细胞迁移和侵袭能力。结果原发性肝癌组织中CCDC34阳性表达率显著低于癌旁正常组织(P<0.001)。CCDC34阴性表达率在不同TNM分期、淋巴结转移、分化程度的原发性肝癌患者间比较差异有统计学意义(P<0.01)。CCDC34阴性表达组3年生存率低于CCDC34阳性表达患者，差异有统计学意义(P<0.001)。CCDC34高表达组人原发性肝癌细胞中CCDC34蛋白相对表达量高于空载体转染组、空白对照组，差异有统计学意义(P<0.001)。随着培养时间的延长，各组人原发性肝癌细胞增殖能力逐渐提升；转染第5、7天时CCDC34高表达组细胞增殖能力明显低于阴性对照组、空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。CCDC34高表达组人原发性肝癌细胞迁移率、侵袭细胞数明显低于阴性对照组、空白对照组，差异有统计学意义(P<0.01)。结论原发性肝癌组织中CCDC34低表达，与病理特征和生存预后相关；上调人原发性肝癌细胞中CCDC34表达能够抑制细胞增殖、迁移和侵袭。

关键词：
卷曲螺旋结构域34
原发性肝癌
慢性肝炎
细胞增殖
肝硬化
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肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,发展中国家的发病率和死亡率均高于欧美发达国家〔1〕｡受中国慢性肝炎､肝硬化高发病率的影响,肝癌发病率居高不下,在老年人群中的发病率更高〔2〕｡老年肝癌患者因生理功能衰退及其他慢性疾病共存,导致肝癌的症状不够典型,容易被忽视或误诊;加之身体条件､合并疾病的限制,使得临床治疗更加复杂,提高早期诊断率是改善预后的关键〔3〕｡卷曲螺旋结构域(CCDC)是一类在多种蛋白质中发现的保守结构域,与基因异常表达､信号传导调控､肿瘤血管生成等密切相关〔4〕｡CCDC34作为CCDC家族成员之一,位于人类染色体上,在多种生物学过程中发挥作用,但具体功能尚未完全明确〔5〕｡相关研究显示,CCDC34表达可能与细胞分裂､细胞周期调控､细胞内运输等活动相关〔6〕｡本课题组通过查询HPA数据库发现CCDC34mRNA在肝癌中表达下调,推测CCDC34可能参与了肝癌的病情发展｡本研究拟分析原发性肝癌组织中CCDC34表达特点及其对肝癌细胞活性的影响｡

1、材料与方法

1.1研究对象选取2020年4月至2021年2月在南阳市第一人民医院行手术治疗的老年原发性肝癌患者95例｡入选标准:①年龄≥60岁,经组织病理学检查确诊为肝细胞癌;②首次确诊,符合手术指征,自愿接受手术治疗;③了解本研究目的,自愿配合完成随访｡排除标准:①合并其他组织脏器恶性肿瘤;②患精神疾病,无法配合本研究｡其中男73例,女22例;年龄60~78岁,平均(68.91±5.08)岁;分化程度:低分化62例,中分化23例,高分化10例,本研究已通过医院伦理委员会审批｡

1.2材料与主要试剂收集手术切除的肝癌癌组织和癌旁正常组织,立即放入冰冻保存液中,之后在冷冻切片机上进行快速冷冻处理,切割成4μm厚切片｡人原发性肝癌细胞株QGY⁃7703购于上海誉弛生物有限公司;RPMI1640细胞培养基､胎牛血清购于上海澳睿赛生物有限公司;CCDC34慢病毒质粒购于苏州爱康得生物有限公司;脂质体3000购于美国Invitrogen;CCK⁃8试剂盒､基质胶购于深圳默赛尔生物有限公司;兔抗人CCDC34单克隆抗体､兔抗人β⁃actin单克隆抗体､辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗､二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购于美国Epitomics公司｡

1.3免疫组化法检测CCDC34表达将组织标本切片固定于载玻片上,使用酶消化法对切片进行抗原修复以暴露出CCDC34抗原决定簇,3%过氧化氢处理切片以阻断内源性过氧化物酶活性,非免疫血清封闭非特异性结合位点,将切片与稀释后的一抗(针对CCDC34的特异性抗体)孵育,4℃过夜;次日清洗切片,去除未结合的一抗,将切片与稀释后的二抗孵育,室温下2h,使用显色剂DAB进行显色反应,苏木素对切片进行复染,使用中性树胶封片｡显微镜下观察并拍摄染色结果,染色强度评估:0分为无染色､1分为弱阳性､2分为中等阳性､3分为强阳性;阳性细胞比例评估:0分为<10%､1分为10%~30%､2分为31%~60%､3分为>60%;计算二者乘积,>3分为阳性表达｡

1.4资料收集与随访收集老年原发性肝癌患者人口学资料､TNM分期､淋巴结转移情况､肿瘤直径､分化程度｡术后对患者进行3年随访,前2年每3个月随访1次,第3年每6个月随访1次,重点监测患者是否有复发迹象,记录患者生存情况｡

1.5细胞培养将人原发性肝癌细胞株QGY⁃7703接种到培养皿中首次培养,使用含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养基,37℃､5%CO2浓度下进行孵育,观察细胞生长状态,定期更换培养基,当细胞长满培养皿底部时,使用胰蛋白酶消化细胞,待细胞变圆并开始脱离瓶壁时加入培养基终止消化｡吸取细胞悬液,分装到新培养皿中,进行传代培养｡

1.6慢病毒稳定上调CCDC34细胞模型构建将人原发性肝癌细胞株QGY⁃7703接种到6孔板中,培养至细胞生长融合度70%以上时进行慢病毒包装,共转染含有CCDC34过表达序列的慢病毒载体质粒和包装质粒,继续培养直至病毒颗粒组装并释放到培养基中｡将慢病毒颗粒与人原发性肝癌细胞共孵育使细胞感染病毒,24h后更换完全培养基,筛选稳定细胞株,从筛选后的细胞中挑取单细胞克隆进行扩增,设置为CCDC34高表达组｡同时设置阴性对照组(使用空白对照质粒转染)及空白对照组(常规培养)｡

1.7Western印迹检测CCDC34蛋白表达向3组细胞中加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(含有蛋白酶抑制剂),冰上孵育30min,将裂解好的细胞悬液离心收集上清液即为蛋白提取物;二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白浓度定量,加入上样缓冲液,加热至95℃,维持5min使蛋白变性,恒压下进行十二烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰凝胶电泳(SDS⁃PAGE),将凝胶､滤纸､转膜､滤纸按顺序放入转膜夹中进行湿转,适当电流下转模1h,清洗后室温下封闭1h,将封闭好的膜与兔抗人CCDC34､β⁃actin单克隆抗体混合,稀释倍数均为1∶1000,4℃冷藏过夜,次日洗涤膜以去除未结合的一抗,将膜与HRP标记的二抗混合,室温孵育2h,再次洗涤,使用化学发光显色剂进行显色反应,成像系统扫描结果并记录｡

1.8细胞增殖能力检测将3组细胞悬液接种到96孔板中,100μl/孔,每个样本设置5个平行对照,37℃､5%CO2浓度下培养至细胞贴壁生长,分别培养1､3､5､7d,将CCK⁃8试剂(10μl/孔)加入反应孔中,继续培养2h使CCK⁃8与细胞充分反应,使用酶标仪在450nm波长下检测吸光度(OD)值｡

1.9细胞迁移和侵袭能力检测将3组细胞接种到24孔板中,37℃､5%CO2浓度下培养至细胞汇合80%~90%时,使用200μl无菌枪头垂直于培养板制造划痕,尽量保证划痕宽度一致,清洗掉划痕产生的细胞碎片,加入无血清培养基以减少细胞增殖对迁移的影响,继续培养24h后使用显微镜拍摄划痕区域,使用图像分析软件计算细胞迁移率｡Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力,按照1∶8稀释倍数将基质胶与无血清培养基混合后加入Transwell小室中,放入培养箱中孵育2h使基质胶凝固;将3组细胞接种到铺好基质胶的Tran⁃swell小室中,加入无血清培养基,将小室放入24孔板中,下室加入含有10%胎牛血清的完全培养基作为趋化因子,将24孔板连同Transwell小室一起放入培养箱中孵育24h以允许细胞侵袭;取出Transwell小室,小心吸去上室中的培养基和未侵袭的细胞,使用4%多聚甲醛固定侵袭到下室细胞30min,使用结晶紫染色后显微镜下观察侵袭到下室的细胞并计数｡

1.10统计学分析采用SPSS25.0软件进行方差分析､t检验､χ2检验及Kaplan⁃Meier曲线分析｡

2、结果

2.1原发性肝癌组织中CCDC34表达特点原发性肝癌组织中CCDC34阳性表达率〔29例(30.53%)〕低于癌旁正常组织〔82例(86.32%)〕,差异有统计学意义(χ2=37.492,P<0.001)｡

2.2CCDC34阴性表达与原发性肝癌患者临床病理参数的关系CCDC34阴性表达率在不同TNM分期､淋巴结转移､分化程度患者间差异有统计学意义(P<0.01)｡见表1｡

表1CCDC34阴性表达与原发性肝癌患者临床病理参数的关系〔n(%)〕

2.3CCDC34表达与原发性肝癌患者生存预后的关系Kaplan⁃Meier生存曲线分析显示,CCDC34阴性表达的原发性肝癌患者3年生存率低于CCDC34阳性表达患者,差异有统计学意义(Log⁃rankχ2=17.292,P<0.001)｡见图1｡

图1不同CCDC34表达的原发性肝癌患者3年生存情况Kaplan⁃Meier曲线

2.4各组CCDC34蛋白表达水平比较CCDC34高表达组人原发性肝癌细胞中CCDC34蛋白相对表达量(3.17±0.59)高于空载体转染组(1.24±0.38)､空白对照组(1.29±0.44),差异有统计学意义(t=16.829､16.671,均P<0.001)｡见图2｡

图2Western印迹检测各组CCDC34蛋白表达

2.5各组细胞增殖能力比较随着培养时间的延长,各组人原发性肝癌细胞增殖能力逐渐提升｡转染第5､7天时CCDC34高表达组细胞增殖能力明显低于阴性对照组､空白对照组(P<0.01)｡见表2｡

2.6各组细胞迁移和侵袭能力比较CCDC34高表达组人原发性肝癌细胞迁移率､侵袭细胞数低于阴性对照组､空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)｡见表2｡

表2各组细胞增殖､迁移和侵袭能力比较(x±s,n=5)

3、讨论

随着年龄增长,老年人肝功能逐渐下降,加之可能伴有其他慢性疾病,使得原发性肝癌对老年人的影响更加复杂和严重〔7〕;此外,老年人的身体条件会限制治疗手段的选择,手术风险高､放化疗耐受性低､药物治疗的副作用可能更加明显〔8〕｡因此,提高老年原发性肝癌的早期诊断率和病情评估水平对治疗方案的个体化制定,改善患者预后具有重要参考价值｡CCDC34中的CCDC在蛋白质与蛋白质之间相互作用中发挥重要作用〔9〕｡相关研究显示,CCDC34在乳腺癌组织和细胞中表达下调〔10〕,但在非小细胞肺癌中的表达上调〔11〕,与肿瘤增殖和侵袭性有关｡CCDC34可能参与磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等多条信号通路调控,进而在肿瘤细胞生存､增殖和迁移中发挥关键作用〔12〕｡本研究结果提示,CCDC34在老年原发性肝癌中低表达,可能参与病情的发生与发展｡TNM分期综合原发肿瘤､淋巴结转移､远处转移的信息,有助于决定治疗方案和评估预后〔13〕;淋巴结转移是肝癌患者预后的一个重要预测因素,分化程度能够反映肿瘤生物学行为和侵袭性,二者作为参考指标对治疗方案的选择具有重要参考价值〔14〕｡本研究结果提示,CCDC34表达与原发性肝癌患者病情严重程度密切相关,可作为参考指标用于病情评估｡

本研究进一步通过脂质体转染技术上调人原发性肝癌细胞中CCDC34表达,Western印迹检测结果提示,人原发性肝癌细胞CCDC34高表达模型成功建立｡相关研究显示,CCDC34可通过影响p21､CDKs､PI3K/Akt等细胞周期相关蛋白和信号通路来调节胃癌的细胞周期进程,进而影响其增殖活性〔15〕｡本研究结果提示,人原发性肝癌细胞中CCDC34高表达能够抑制细胞增殖,但具体分子机制仍需深入研究｡研究发现,CCDC34高表达可通过抑制细胞骨架重组,提升细胞间黏附作用,降低细胞与胞外基质的相互作用,减弱肺癌细胞的迁移､侵袭能力〔16〕｡本研究结果提示,CCDC34表达上调能够抑制原发性肝癌细胞的迁移率和侵袭细胞数,对于理解肝癌侵袭和转移机制具有重要意义,并为开发新的治疗策略提供了潜在靶点｡

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