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肝细胞肝癌组织中HMMR表达与患者临床特征及预后的相关性

2021-03-05 406 上传者：管理员

摘要：目的:研究透明质酸介导的运动受体(hyaluronan-mediatedmotilityreceptor,HMMR)的表达与肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)的发生发展以及预后的关系。方法:在本研究中,我们通过从癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas,TCGA)数据库中下载HCC有关的数据进行生物信息学分析,探讨HMMR表达在HCC发生、发展和预后中的价值。根据HMMRmRNA表达的中位值将患者分为两组(HMMR高表达组和HMMR低表达组),应用Kruskal-Wallis检验和Logistic回归分析HMMR表达与患者临床特征之间的关系,利用Kaplan-Meier和Cox分析观察HMMR表达对HCC患者生存的影响,并进行PPI蛋白互作网络、GO富集和KEGG通路分析。最后通过实时荧光定量PCR(quantitativereal-timePCR,qRT-PCR)验证HMMRmRNA在HCC组织样本中的表达。结果:HCC组织中HMMR的高表达与组织学分级(G3vsG1,OR=2.675)、癌组织阶段(ⅢvsⅠ，OR=2.509)、T分期(T4vsT1,OR=3.568)相关(P均<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示，HMMR高表达的HCC预后比HMMR低表达的患者差(P=6.858E-05)。Cox分析显示HMMR高表达是总体生存(overallsurvival,OS)的危险因素(HR:1.166,95%CI:1.027～1.324,P=0.018)。PPI蛋白互作、GO富集和KEGG通路分析鉴定了与HMMR存在相互作用的10个基因，分别为:FAM83D、CD44、TPX2、PLK4、AURKA、PLK1、NEK2、CDK1、BUB1及DLGAP5，它们主要富集在有丝分裂细胞周期相变的调控、细胞周期过程、ECM-受体相互作用、FoxO信号通路、EB病毒感染等。qRT-PCR结果显示，HMMRmRNA在HCC癌组织中高表达(P<0.05)。结论:HMMRmRNA的高表达与HCC的发生发展密切相关，是HCC预后不良的独立危险因素。

关键词：
HMMR
生物信息学
生物标志物
肝细胞肝癌
预后
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肝细胞肝癌(HCC)是一种常见的侵袭性癌症,其发病率占全球恶性肿瘤发病率的第六位,死亡率位居第四位[1]。有研究表明,与HCC有关的死亡率有逐渐升高的趋势[2],已知肝癌治疗困难,预后不良[3],因此,发现和识别与HCC发生、发展和预后有关的潜在的生物标志物及其可能涉及的分子机制至关重要。

透明质酸介导的运动受体(hyaluronanmediatedmotilityreceptor,HMMR,也称CD168或RHAMM)最初被认为是一种新型的透明质酸受体,可以调控细胞运动[4],HMMR可在胚胎干细胞(embryonicstemcell,ESC)中表达,对维持ESC的多能性和增殖具有重要作用[5]。HMMR在正常组织中表达较低[6],过表达可导致中心体和有丝分裂异常[7]。已发现在多种肿瘤中HMMR过表达,且HMMR的过表达与肿瘤的发生发展密切相关,已有多项研究表明HMMR可以作为癌症的预后因子,如有研究者称HMMR的表达可能是乳头状肌浸润性膀胱癌无进展生存期的特异性预后标志物[8];HMMR的表达与卵巢癌的预后有关[9];除此之外,HMMR表达还可以作为胃癌的预后标志物[10]。但关于HMMR与HCC的关系,及其潜在的分子机制的研究目前报道较少。因此,进一步研究HMMR与HCC发生发展及不良预后的关系以及可能涉及的分子机制,具有重要意义。

在本研究中,我们在TCGA数据库中鉴定了HMMRmRNA在HCC癌组织和正常组织中的表达情况。并根据TCGA数据库的临床信息,探讨了HMMR表达与HCC临床特征和患者总体生存期(overallsurvival,OS)之间的相关性,并且通过PPI、GO富集和KEGG通路分析等发现可能与HMMR调控机制有关的信号通路,最后利用48对来自广西医科大学附属肿瘤医院的HCC组织进行qRT-PCR验证HMMR的表达,结果证明HMMR可能是一个与HCC诊断和预后有关的分子标志物。

1、资料与方法

1.1数据来源

本研究的数据(RNA-Seqgeneexpressionlevel3HTSeq-Counts)是从HCC癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas-liverhepatocellularcarcinoma,TCGA-LIHC)数据库中下载,一共包括371个文件,对基因矩阵进行标准化处理。临床资料也来源于TCGA数据库,一共包括377个临床资料文件,保留371例HCC患者的临床资料并进行进一步分析(表1)。所有数据均使用R包进行处理(版本3.6.0)。

1.2HMMR表达与患者临床特征相关性分析

TCGA-LIHC数据库中HMMR在肝癌患者的癌组织和正常组织中的表达情况,通过HMMRmRNA表达的中位数将患者分为高低表达两组,运用R包采用Kruskal-Wallis检验和Logistic回归分析HMMR与HCC患者临床病理特征的关系。通过Kaplan-Meier分析比较两组的OS,并使用R包中的生存包通过Log-rank回归检验计算P值。采用Cox分析筛选可能的预后因素,P<0.05为差异具有统计学意义。

表1TCGA数据库中HCC患者的特点

1.3PPI相互作用、GO分析和KEGG通路富集分析

String(https://www.string-db.org)是主要用来在线分析基因的网站[11],可以了解蛋白质-蛋白质相互作用,GO分析主要用于对基因进行注释,由三大类组成:生物过程(biologicalprocess,BP)、细胞成分(cellularcomponent,CC)和分子功能(molecularfunction,MF)。KEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes,www.kegg.jp)网站是一个在线数据库,主要包含已定义和相关的基因集及其参与的途径[12]。为了确定HMMR表达影响HCC发生发展的潜在机制,本研究将HMMR导入到String中进行分析,并对与HMMR相互作用的基因组进行GO富集注释和KEGG信号通路分析,P<0.05或FDR<0.05表示差异具有统计学意义。

1.4组织样本

本研究所用的HCC组织均来自2016年01月至2018年12月期间,在广西医科大学附属肿瘤医院接受手术的患者,一共获取48例HCC组织及其邻近正常组织(临近正常组织为与HCC组织至少3cm距离且经病理证实)。HCC组织样本均被保存在液氮中。所有HCC患者术前均未接受放疗或化疗,由两名具有丰富临床经验的病理医师诊断。所有参与者在参与研究前均签署了知情同意书。本研究经广西医科大学伦理委员会批准。

1.5qRT-PCR

使用Trizol试剂(Invitrogen)从组织中提取总RNA,使用NanoDrop2000分光光度计来检测所提取的RNA的浓度和纯度,然后按照产品说明使用高容量cDNA逆转录试剂盒(RR047A,TaKaRa)将RNA逆转录合成cDNA。按照Takara荧光定量PCR试剂盒(RR820A,TaKaRa)对HMMR基因进行检测,以GAPDH为内参。HMMR和GAPDH引物的序列如下:HMMR-forward:5′-AAGAGAAACAAAGATGAGGGGT-3′,HMMR-reverse:5′-GGCTATTTTCCCTTGAGACTCT-3′;GAPDH-forward:5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,GAPDH-reverse:5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。qRT-PCR的反应条件是先95℃预变性30秒,然后95℃变性5秒,最后60℃退火并延伸34秒,一共需要进行40个循环,最后结果用2-△CT的方法分析。采用SPSS.22版本统计软件进行分析,结果使用配对t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1TCGA数据库HCC组织中HMMRmRNA高表达

比较TCGA数据库HCC癌组织和正常组织中HMMR的表达情况(图1A),结果显示HCC癌组织中HMMR表达升高(P=1.243E-25);比较配对t检验的癌和正常组织中HMMR的表达情况(图1B),结果显示HMMR在HCC癌组织中高表达(P=1.81E-14),差异具有统计学意义。

图1TCGA数据库HCC组织中HMMRmRNA的表达情况

2.2TCGA数据库HCC组织中HMMRmRNA表达与临床特征的相关性

分析TCGA数据库中HMMR表达与HCC患者临床特征的关系。根据生存状态、性别、年龄、组织学分级、癌组织阶段和TNM分期观察HMMRmRNA的表达(图2),其中,在生存状态、组织学分级、癌组织阶段、T分期中HMMRmRNA差异具有统计学意义(P=0.001,P=2.451E-04,P=8.386E-05,P=1.409E-04),以HMMRmRNA表达量的中位数(323)为界限,分为高表达和低表达两组。使用Logistic回归单因素分析HMMR表达与HCC临床特征的关系(表2),结果显示,HMMR的高表达与组织学分级(G3vsG1,OR=2.675)、癌组织阶段(ⅢvsⅠ,OR=2.509)、T分期(T4vsT1,OR=3.568)相关,差异具有统计学意义(P均<0.05),这些结果表明HMMR高表达的HCC比HMMR低表达的HCC更容易进展到晚期。

2.3HMMR高表达可能是HCC患者OS的危险因素

根据癌组织中HMMRmRNA的表达,我们将患者分为两组(高表达组和低表达组),Kaplan-Meier曲线显示,HMMR高表达与肝癌患者OS较差有关(P=6.858E-05,图3)。Cox分析显示HMMR的表达是HCC患者OS的危险因素,风险比(hazardratio,HR)为1.166,95%CI为1.027～1.324,P=0.018,差异具有统计学意义,此外,癌组织阶段、T分期、N分期也可能是HCC患者OS的危险因素,见表3。

图2HCC组织中HMMRmRNA的表达与患者临床特征的相关性

表2HMMR表达与临床病理特征相关性

图3HMMR表达与TCGA数据库中HCC患者OS的相关性

2.4PPI、KEGG和GO分析结果

PPI分析结果显示,FAM83D、CD44、TPX2、PLK4、AURKA、PLK1、NEK2、CDK1、BUB1及DLGAP5这10个基因与HMMR存在相互作用关系(图4)。GO分析结果显示,与HMMR相互作用的基因组主要富集在蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、碳水化合物衍生物结合、细胞周期相变的调控、有丝分裂细胞周期相变的调控、细胞周期过程、微管组织中心、微管细胞骨架等(表4)。涉及的KEGG通路主要为孕激素介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂、细胞周期、ECM-受体相互作用、FoxO信号通路、EB病毒感染(表5)。

表3影响HCC患者OS的单因素分析

图4String中HMMR蛋白质的相互作用网络图

2.5HMMRmRNA在48例HCC癌组织中高表达

为了验证HMMR与HCC的关系,本研究采用qRT-PCR对从广西医科大学附属肿瘤医院获取的48对HCC癌和正常组织进行分析,发现,相对于正常组织来说HMMRmRNA在HCC癌组织中表达更高(P=6.7277E-08),差异具有统计学意义(表6及图5)。

表4与HMMR相互作用基因组的GO分析结果

表5与HMMR相互作用基因组的KEGG主要富集通路

表648例HCC组织中HMMRmRNA的表达水平

3、讨论

肝癌发病率逐年上升,其死亡率较高[13]。HCC约占原发性肝癌的80%[14],虽然HCC的综合治疗日益完善[15],但HCC的发病率和死亡率仍处于较高水平[16]。因此,发现HCC潜在的诊断和预后生物标志物至关重要。

图548例HCC组织中HMMRmRNA的表达

本研究主要通过分析TCGA数据库中HMMRmRNA在HCC组织和正常组织中的表达,发现HMMR在HCC组织中高表达,进一步通过对来自广西医科大学的48例HCC组织进行qRT-PCR分析,也显示HMMR在HCC组织中是高表达的,这与既往研究中HMMR在多种肿瘤中高表达一致,且既往研究表明HMMR过表达与肿瘤的发生发展及预后密切相关,如MELE等[17]发现过表达HMMR可以促进结直肠癌细胞的生长、侵袭和扩散,而下调肺腺癌细胞中HMMR的表达则抑制癌细胞的迁移能力[18],HMMR的过表达还与卵巢癌的进展有关[9],此外HMMR还可以通过GFβ/Smad2而影响胃癌对化疗的敏感性[19]。而本研究也发现HMMR的高表达与HCC患者组织学分级、癌组织阶段、T分期有关,且常伴随着差的生存状态,此外通过OSKaplan-Meier曲线也显示,HMMR的高表达与HCC患者预后较差有关。进一步通过Cox分析也表明HMMRmRNA表达可能是HCC预后的一种有用的生物标志物,这与既往研究的结论一致[20]。且近期也有报道称,乙型肝炎病毒蛋白X(hepatitisBvirus'sproteinX,HBX)可以促进HMMR的表达,增加肝癌细胞迁移和侵袭的能力,而降低HMMR的表达则抑制了肝癌细胞的迁移和侵袭[21]。这些均提示HMMR的表达可能与HCC的发生发展及预后存在密切的关系。

此外,我们通过蛋白互作网络研究与HMMR存在相互作用的蛋白,通过KEGG通路和GO生物学分析发现,HMMR参与微管细胞骨架构成,涉及细胞周期调控,这可能是HMMR参与调控肿瘤进展的原理。值得我们进一步的去研究其中潜在的分子机制。

本研究进一步的证明了HMMR在HCC患者中确实是高表达的,与HCC患者组织学分级、癌组织阶段、T分期有关,且常常伴随着不良预后,可能作为HCC患者潜在的分子标志物。虽然本研究检测了48对HCC组织中mRNA的表达,但没有进一步的进行机制探究,HMMR与肝癌发生发展存在的潜在分子机制值得我们去挖掘。

王敏,陈泽峰,韩志伟,邬国斌,陈闯,黄山,赵荫农.基于TCGA数据库分析肝细胞肝癌组织中HMMR表达与患者临床特征及预后的相关性[J].现代肿瘤医学,2021,29(07):1173-1178.

基金:中央引导地方科技发展专项(编号:桂科ZY1949017);广西高校中青年教师基础能力提升项目(编号:2018KY0126)