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有氧运动调节肝癌患者MAGED1水平、炎症反应

2021-07-05 127 上传者：管理员

摘要：目的：探讨肝癌患者有氧运动后黑色素瘤相关抗原D1（MAGED1）表达与机体炎症反应及脂质代谢的关系。方法：选取2018年1月至2019年12月肝癌患者167例,运动组82人,对照组85人。采用QPCR和Westernblot检测外周血单核细胞MAGED1基因和蛋白表达;ELISA法检测血浆TNF-α、IL-6和IL-10含量,FACs检测CD4+和CD8+T细胞比例;血生化仪检测高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）含量;统计各项指标差异,分析MAGED1与炎症因子和脂代谢指标相关性。结果：运动组患者单核细胞MAGED1表达为0.36±0.08,显著低于对照组0.52±0.09（P<0.001）;运动组TNF-α和IL-6含量为（16.32±5.62）和（71.84±8.27）pg/ml,显著低于对照组（23.86±7.50）和（86.97±10.28）pg/ml,IL-10含量（98.37±26.88）pg/ml,显著高于对照组（61.25±18.39）pg/ml;运动组TG、TC、LDL-C和HDL-C含量为（1.19±0.40）、（4.00±0.98）、（2.06±0.65）、（1.48±0.34）mmol/L,与对照组相比差异显著[（1.49±0.54）、（4.32±0.86）、（2.40±0.68）和（1.26±0.26）mmol/L];MAGED1表达与TNF-α（r=0.395）、IL-6（r=0.592）呈正相关,与IL-10呈负相关（r=-0.683）,与TG、TC和LDL-C呈正相关（r=0.432、0.556、0.369）,与HDL-C为负相关（r=-0.519）,与CD4+T的百分比和NK的百分比呈负相关（r=-0.546、-0.368）,与CD8+T的百分比为正相关（r=0.279）。结论：MAGED1在有氧运动改善肝癌患者脂质代谢和炎症反应中具有一定的作用。

关键词：
MAGED1
有氧运动
炎症反应
肝癌
脂质代谢
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原发性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC），也被称为肝癌，全球每年新增患者数为841080人，排名第6位；死亡人数为781631人，排名第4位[1]。好发于男性，发生率为6.3%，死亡率为10.2%，是我国第5大死亡原因。目前临床上60%～70%的肝癌被确诊时已到中晚期，不具备手术指征，只能进行保守治疗或姑息疗法[2]。恶性肿瘤本身以及保守治疗引起了一系列生理、心理的影响，如何提高患者带瘤生存期存活质量是医学领域关注的焦点之一。近年来，有氧运动作为肿瘤康复的主要行为干预方式，被众多研究证实其对机体的益处：有效改善疲乏、提高免疫功能、抑制肿瘤细胞生长、改善抑郁等。

黑色素瘤相关抗原D1(melanomaantigenfamilyD1,MAGED1）是黑色素瘤相关抗原家族的成员之一，泛表达于各组织中，参与调控细胞增殖和凋亡、转录调控、蛋白质稳定性、脂质代谢及免疫反应等[3]。研究表明其参与调控食管癌、乳腺癌、舌癌等恶性肿瘤的发生发展，但其在肝癌中的作用及与肝癌患者脂质代谢和炎症反应的关系尚不清楚[4,5]。本研究通过观察临床肝癌患者外周血单核细胞MAGED1的表达及其和脂质代谢及炎症反应的关系，进而探明MAGED1在肝癌患者有氧运动锻炼中的作用。

1、对象与方法

1.1研究对象

选取2018年1月到2019年12月在我科诊治的肝细胞癌患者167例，诊断标准根据卫生部制定的2017版原发性肝癌诊疗规范。排除心肺功能异常、急性感染及孕妇及哺乳期妇女，有规律运动习惯者。随机分为对照组（control)85人，男性61人，女性24人，平均年龄（58.27±6.45）岁，Ⅰa、Ⅰb期37人，Ⅱa、Ⅱb期9人，Ⅲa、Ⅲb期16人，不确定者23人；运动组（treadmilltraining,TT)82人，男性66人，女性16人，平均年龄（57.21±6.32）岁，Ⅰa、Ⅰb期26人，Ⅱa、Ⅱb期10人，Ⅲa、Ⅲb期20人，不确定者26人。2组在年龄、性别、疾病分期等方面无统计学差异，具有可比性。本研究已获得医院伦理委员会批准（E2017009）及受试者知情同意。

1.2运动方案

运动类型参照美国癌症协会（ACS）为非住院患者推荐的适度运动种类：如快走、慢跑、上下楼梯、健身操、踢腿运动、广场舞等。运动处方依据美国运动医学会（Americancollegeofsportsmedicine,ACSM）为非临床人群推荐的中等强度有氧运动处方：每周5d，每次30min，每天最少5500～8000步活动量。运动强度根据Borg自觉劳累分级量表（Borg’sperceivedexertionscale）确定中运动强度评分为11～13分。课题组成立居家有氧运动干预团队指导参与者进行居家有氧运动锻炼，包括2周院内学习期及12周居家锻炼行为管理期。

1.3主要试剂

TRIzol试剂、HiScriptIIQRTSuperMixforqPCR(+gDNAwiper）、AceQqPCRSYBRGreenMasterMix(HighROXPremixed）和BCA定量试剂盒购自中国诺唯赞公司，TNFα和IL-6ELISA试剂盒购自上海优选生物。MAGED1抗体购自Abcam公司，CD4和CD8抗体购自eBioScience公司。

1.4标本采集

所有入组病例均于试验开始当天及12周后取清晨空腹静脉血5ml置于抗凝管中，3000r/min低温离心，收集上层血浆，冻存备用。其余组份用于分离单核细胞。

1.5单核细胞分离

分离方法同前人报道[5]，简言之，即用Hank’s平衡液等体积稀释1.3中余留组份，充分混匀后缓慢加入预置淋巴分离液的离心管中，2种液相不可混合。2000r/min于室温下离心20min。吸取白色狭窄带细胞层，转移入新离心管，用5倍体积Hank’s平衡液洗涤（1500r/min,10min），弃去上清，留存单核细胞。

1.6检测MAGED1基因的表达

TRIzol裂解法获取RNA，按照说明书步骤合成cDNA，随后用QPCR法检测MAGED1基因表达。引物序列见表1。用GAPDH作内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。引物序列如下：MAGED1F:TGTGGCCCTTCTTCAGGAAA,R:5’-TCAGCATTTCTGAGCGCTTG-3’，产物长度为95bp;GAPDHF:5’-TTCCACCCATGGCAAATTCC-3’,R:5’-ATCTCGCTCCTGGAAGATGG-3’，产物长度为94bp。

1.7Westernblot检测MAGED1表达

单核细胞中加入100µl完全RIPA裂解液（Radioimmunoprecipitationassaylysis）提取蛋白，BCA法测定浓度后均一化，煮沸变性后用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿法转移到PVDF膜。5%的脱脂奶粉室温封闭1h,4℃下一抗封闭液（1∶1000）孵育过夜。TBST洗涤后室温孵育HRP偶联二抗2h，随后ECL显影，天能凝胶成像系统采集结果，ImageJ进行灰度分析并统计作图，以GAPDH为内参。

1.8ELISA法检测血浆细胞因子

按照厂家说明书进行血浆中TNF-α和IL-6的检测。

1.9血浆脂质检测

利用全自动生化分析仪（BECKMAN-AU5800）检测高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）。

1.10流式细胞术检测CD4+和CD8+的T细胞比例

将分离的单核细胞用PBS调整为每管100µl，约含有1×106个细胞。应用双色直接免疫荧光法标记单核细胞膜表面CD4和CD8，操作过程严格遵守试剂盒说明书。

1.11统计学分析

数据采用软件进行统计分析。数据采用均数±标准差描述，2组间采用t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1运动组和对照组外周血单核细胞MAGED1表达

运动组病人外周血单核细胞中MAGED1转录水平显著高于对照组（表1,P<0.001）；同时，运动组MAGED1翻译水平亦显著高于对照组（图1、表2,P<0.001）。

表1对照组和运动组病人外周血单核细胞中MAGED1基因表达

图1对照组和运动组病人外周血单核细胞中MAGED1蛋白表达

表2对照组和运动组病人单核细胞中MAGED1蛋白表达灰度分析

2.2运动组和对照组血浆细胞因子含量

与对照组病人相比，运动组病人血浆中TNF-α显著降低（P<0.010),IL-6极显著降低（P<0.001），然而，IL-10的含量则极显著升高（P<0.001），见表3。

表3对照组和运动组病人血浆中TNF-α、IL-6和IL-10的含量

2.3运动组和对照组血浆脂质含量

与对照组相比，运动组血浆中脂质代谢相关指标均显著改变。其中甘油三酯（TG）下降约20.13%(P<0.001），总胆固醇（TC）下降7.41%(P<0.05），低密度脂蛋白（LDL-C）下降约14.17%(P<0.01），高密度脂蛋白（HDL-C）上升约17.46%(P<0.001），见表4。

表4对照组和运动组病人血浆中TG、TC、LDL和HDL的含量

2.4运动组和对照组CD4+、CD8+T和NK细胞比例

与对照组病人相比，运动组病人血浆中CD4+T细胞比例极显著升高（图2a、2d，表5,P<0.001),CD8+T细胞比例差异不显著（图2b、2e，表5,P>0.05),CD4+/CD8+T细胞比例极显著升高（表5,P<0.001),NK细胞比例显著升高（图2c、2f，表5,P<0.05）。

图2对照组和运动组病人血浆中CD4+、CD8+T和NK细胞流式分选图

2.5MAGED1与炎症因子的相关性

外周血单核细胞MAGED1表达与血浆中TNF-α（r=0.395,P<0.01）和IL-6(r=0.592,P<0.001）呈负相关，而与IL-10(r=-0.683,P<0.001）呈正相关，见表6。

表5对照组和运动组病人血浆中CD4+、CD8+T和NK细胞比例

表6外周血单核细胞MAGED1表达与炎症因子的相关性

2.6MAGED1与血脂相关性

外周血单核细胞MAGED1表达与TG(r=0.432,P<0.001）、TC(r=0.556,P<0.001）以及LDL-C(r=0.369,P<0.001）均呈现负相关，而与HDL-C(r=-0.519,P<0.001）呈正相关，见表7。

2.7MAGED1与CD4+、CD8+细胞比例相关性

外周血单核细胞MAGED1表达与血液中CD4+T%(r=-0.546,P<0.001）、CD4+/CD8+(r=-0.628,P<0.001）以及NK%(r=-0.368,P<0.001）均呈正相关，而与CD8+T%(r=0.279,P<0.001）呈负相关，见表8。

表7外周血单核细胞MAGED1表达与血液脂质含量的相关性

表8外周血单核细胞MAGED1表达与免疫细胞比例相关性

3、讨论

原发性肝细胞癌为消化系统高发的恶性肿瘤，全球发病率较高，我国肝癌患者人数超过全球病患数50%[6]。早期诊断指标的缺乏导致病患确诊时已经多处于中晚期，治疗后生存率依然较低[7]。因此，肝癌的早期诊断有助于提高病患治疗效果，提升其生存时间和生活质量。

有氧运动是以运动为基础的康复治疗手段之一，长期规律的有氧运动能够提高局部组织血流动力学[8]、改善氧气供应[9]、增强线粒体功能、促进有氧代谢[10]、降低血脂和免疫反应[11]、改善患者生活质量[12]。本研究对肝癌病人进行有氧运动干预，结果表明运动能够有效降低病人外周血单核细胞中MAGED1的表达，降低血浆中促炎因子TNF-α和IL-6的表达，提高抗炎因子IL-10的表达，同时改善T细胞和NK细胞的比例，进一步验证了有氧运动在肝癌病人康复过程中的作用。

MAGED1属于II型黑色素抗原家族成员之一，也被称作NRAGE(neurotrophinreceptorinteractingMAGEhomolog）或DLXIN-1，被报导参与细胞周期调控、细胞黏附、细胞分化，凋亡及发育等多个生物学过程[13]。已有报道多关注于其抗肿瘤特性[13,14]及生物钟调控[15]，亦有报道指出其具有调节脂肪前体细胞发育功能并进而参与糖脂代谢调控途径[16]。MAGED1不改变乳腺癌细胞的细胞周期和凋亡，而上调p53、p21和E-cadherin表达，下调β-catenin表达而抑制了其迁移和侵袭[16]。主流研究报道认为MAGED1主要通过泛素化AATF促进凋亡，发挥肿瘤抑制子作用[17]。但也有报道认为MAGED1能够通过与PCNA或Wnt通路互作而促进细胞增殖或增加细胞对射线的抗性[18]。然而，MAGED1在肝癌组织和肝癌患者血液中高表达[19]，与AATF互作而促进肝细胞肝癌的进展[20]，与肝癌TNM分期呈现强相关[21]。本研究中肝癌患者外周血单核细胞中MAGED1表达在运动后显著下降，表明有氧运动具有一定程度的改善肝癌恶性水平的作用。但本研究并未能检测TNM不同分期病人MAGED1的表达，亦未能利用随访资料探究其与肝癌病人预后之间的关系。

本研究中肝癌患者外周血单核细胞MAGED1表达与TNF-α、IL-6呈正相关，与IL-10呈负相关；与TG、TC、LDL-C呈正相关，与HDL-C呈负相关；与CD8+%呈正相关，与CD4+T%、NK%呈负相关。这些结果为MAGED1作为临床生物标记提供了一定的理论支撑，但深入的机制尚需进一步探索[22]。

总之，本研究探讨了有氧运动干预后肝癌患者MAGED1的表达及其与炎症因子和血脂指标的相关性，为进一步开发利用MAGED1成为肝癌早期诊断生物标记的研究提供了理论基础。

参考文献：

[5]韩晓群,潘炳校,付南燕,等.结核病患者PPARy表达与机体脂代谢及炎症反应的关系[J].免疫学杂志,2020,36(9):816-820.

[6]吕金明李燕苏凤君.miRNA-122联合肿瘤标志物在慢性乙肝病毒感染肝硬化及早期肝癌诊断中的价值[J.中华医院感染学杂志,2020,30(19);2922-2926.

[7]胡仁智,赵世巧,申波,等.血清甲胎蛋白及其异质体和异常凝血酶原对原发性肝癌的诊断价值[J].中华肝脏病杂志,2019,27(8):634-637.

文章来源：戚龙菊,王佳慧,孙泽升,何佳枫,顾思思,余静,沈建东,谢幸尔,王庆华.有氧运动调节肝癌患者MAGED1水平､炎症反应及脂代谢[J].免疫学杂志,2021,37(07):618-623.