1、CircRNA发现、类别、特点

CircRNA是一类缺乏5'-帽和3'-polyA尾的共价环状非编码RNA[1]。1976年Sanger等人发现植物病原性病毒RNA5'和3'不能被酶标记，提示存在环状结构[2],1979年Hsu等人在电镜下观察到真核细胞也存在环状RNA[3]，而最早发现的人类相关circRNA是丁型肝炎病毒（HDV)[4]。circRNA最初被误以为是RNA剪接的副产品或错误的剪接体[5]。在沉寂了一段时间后，随着高通量测序技术的进步，近来大量circRNA被鉴定，重新受到研究者的重视[6]。circRNAs具有以下主要特点：1）丰富性，众多细胞可表达circRNA，一些circRNA较相应线性RNA表达量更高，circRNA可发现于组织、血液及外泌体中[7]，在人成纤维细胞中发现超过25000种，人脑组织中超过65731种circRNA[8],circRNA可经外泌体或微囊运输至细胞外，迄今已在人血清外泌体中发现超过1000种circRNA。2）稳定性，由于circRNA的闭环结构使其不容易被RNaseR降解，相对线性RNA更稳定，半衰期长于48h[9]。3）保守性，circRNA在不同物种间呈现保守性，例如在人和小鼠间发现4%的直系同源基因（orthologousgenes）可表达circRNA。4）特异性，circRNA呈现出表达的时空性，在不同组织，不同阶段特异表达，循环系统中发现的circRNA可反应出远端来源组织的特性[1,9]。circRNA从结构上可分为3类：1）外显子circRNA(exoniccircularRNAs,ecircRNA），通过内含子配对或套索结构驱动，内含子形成共价或套索结构之后可以被去除，由外显子下游3'末端与上游的其他外显子或自身外显子5'末端反向剪接（backsplicing）而成，超过80%的circRNA是ecircRNA[10],ecircRNA这种形成机制也可以称为外显子跳跃机制（exonskipping），外显子跳跃导致mRNA前体上数个外显子的中间几个外显子两侧的内含子序列可形成套索状结构，从而进一步剪接形成circRNA[6]。2）内含子circRNA(intronicRNA,ciRNA），由II型聚合酶（PolⅡ）形成的含套索结构的内含子通过2',5'-磷酸二酯键连接而成，不含线性结构内含子具有的3'末端，当内含子具有富含GU的7个核苷酸5'端和富含C碱基的11个核苷酸的分支结构时，该内含子不会被脱支酶降解，取而代之形成环状结构。间隔circRNA(intergeniccircRNA）是一类特殊的circRNA，由2个侧翼具有GT-AG结构的内含子circRNA连接而成[11]。3）外显子-内含子circRNA(exon-introncircularRNA,EIciRNA），通常由含有外显子和内含子的剪接前体由套索结构驱动形成，一些EIciRNA依赖于RNA结合蛋白（RBP),RBP通过结合上游和下游内含子拉近侧翼内含子，通常含有超过2个以上外显子的EIciRNA较为稳定，否则内含子容易被去除从而形成上文提到的第一种ecircRNA。ecircRNA通常定位在细胞质，ciRNA和EIciRNA则主要存在于细胞核内[1,12]。目前分析circRNA的工具主要有TopHatFusion、MapSplice、findcirc、segemehl、CIRI等[8]，主要有以下数据库供分析circRNA、circBase提供测序数据，circ2Traits列出疾病相关的circRNA,circInteractome和circNet总结了RNA-bindingprotein(RBP)-circRNA,miRNA-circRNA相互作用网络[1]。

2、CircRNA生物学作用

CircRNA与多种生理、病理过程有关，通过多种方式发挥作用，诸如miRNA海绵（miRNAsponging）、替代剪接（alternativesplicing）、Ⅱ类RNA聚合酶延伸（RNAPⅡelongation）、RNA成熟调控、RBP海绵（RBPsponging）等，其中最主要的方式是miRNA海绵，作为竞争性内源RNA(competitiveendogenousRNA,ceRNA），因此circRNA-miRNA-mRNA常在circRNA的功能实验中被研究[13]。Memczak等人在CDR1as(ciRS-7）上发现63个miRNA-7结合位点，率先提出circRNA具有miRNA海绵功能[14]，随后多种circRNA-miRNA配对序列被鉴定，例如circRNASry-miRNA138、circRNAMYLK-miRNA29a等[9]。除了miRNA海绵功能之外，circRNA还可与蛋白相互作用从而影响细胞活动，例如circ-foxo3可与p21、Cdk2形成三元复合物阻碍细胞周期进程。除了上述反式结合之外，一些circRNA，尤其是含有内含子序列的ciRNA或EIciRNA，也具有顺式调控作用，例如EIciRNA可通过RNA-RNA方式与U1snRNA作用，进而EIciRNA-U1snRNP复合体可以通过影响基因启动子区域的PolⅡ结合调控相应基因的表达，顺式调控往往具有正反馈效应[9]。

3、CircRNA在自身免疫疾病中的研究

3.1系统性红斑狼疮（SLE)

目前已有多项研究观察到SLE患者血清、T细胞、外周血PBMC中circRNA差异表达。在血清中，Li的研究发现207种circRNA差异表达，其中113种上调，94种下调，qRT-PCR方法确认了筛选出的8种差异表达的circRNA，并经TargetScan和miRanda软件预测了4种circRNA(hsa:circ＿102584、hsa:circ＿400011、hsa:circ＿101471、hsa:circ＿100226）的MRE(miRNAresponseelement）序列，miRNA种植（miRNAseed）类型，种植区附近AU富集度等[15]。在儿童SLE全血标本中发现348种circRNA和1162种mRNA差异表达，通过ceRNA分析发现竞争性RNA差异包括42种circRNA、41种mRNA、71种miRNA。其中hsa＿circ＿0021372和hsa＿circ＿0075699与C3、C4相关，hsa＿circ＿0057762与疾病活动指数SLEDAI-2K正相关。ROC曲线显示hsa＿circ＿0057762和hsa＿circ＿0003090具有很好的诊断价值[16]。

在T细胞中，Li等人发现SLE患者差异表达127种circRNA,hsa＿circ＿0045272可降低Jurkat细胞凋亡及IL-2分泌，预测模型认为RNANM＿003466(PAX8）和NM＿015177(DTX4）是hsa＿circ＿0045272的ceRNA，荧光素酶报告基因方法发现hsa＿circ＿0045272可与hsa-miR-6127结合[17]。在SLE患者CD4+T细胞中发现12种circRNA上调，2种circRNA下调，其中Hsa＿circ＿0012919显著升高，并与antidsDNA、anti-Sm抗体、关节炎、肾病等临床特点相关。机制研究发现hsa＿circ＿0012919下调DNA甲基转移酶DNMT1，从而下调CD4+T细胞CD11a和CD70甲基化水平[18]。在PBMC中，DNMT1与hsa＿circ＿0049224、hsa＿circ＿0049220都呈下降趋势，与SLE疾病活动指数SLEDAI负相关[19]。DNMT1也在其他SLE研究中被证实下调，并与SLEDAI评分负相关[20]，提示circRNA影响的DNMT1表达在SLE中存在复杂的调控作用。

更多的研究观察到了SLE患者外周血PBMC中circRNA差异表达多达上百种，Zhang的研究发现hsa＿circRNA＿407176和hsa＿circRNA＿001308在SLE患者血浆和PBMC中都降低，血浆中2种circRNA受试者工作曲线ROC(Receiveroperatingcharacteristiccurve）面积分别为0.599和0.662,PBMC中为0.806和0.722[21]。具有诊断意义的还有hsa＿circ＿0000479，对区别SLE与AS、RA、HC最为有效，尤其是使用hsa＿circ＿0000479-anti-dsDNA组合对鉴别SLE敏感度达86.00%(43/50）,特异性达100.00%(93/93）,准确度达95.10%(136/143)[22],hsa＿circ＿0000479在不同SLE疾病阶段中差异显著，进一步提示其在SLE诊断及预后中的作用[23]。在机制研究方面，Wang等人发现circIBTK在SLE患者PBMC中下调，circIBTK结合miR-29b后抑制AKT信号途径并上调甲基化，与SLEDAI、anti-dsDNA、补体C3相关[24]。hsa＿circ＿0000479、hsa＿circ＿0082688等也与补体C3、anti-dsDNA有关[22]，生物信息学分析发现hsa＿circ＿0000479调控代谢和Wnt信号通路[23]。circRNA-miRNA-mRNA网络分析认为circPTPN22与免疫调控有关，长期激素治疗可上调circPTPN22[25]。在狼疮肾病的肾组织中，mmu＿circRNA＿34428[26]、CircHLA-C[27]、circRNA＿002453[28]升高，相应的底物包括miR‐338‐3p、miR‐670‐3p、miR‐3066‐5p、miR‐210‐5p、miR-150等，circRNA＿002453与24h尿蛋白相关，但与疾病活动指数SLEDAI-2K及补体C3、C4无关，ROC曲线面积0.906，敏感度0.900，特异度0.841。上述研究尽管在SLE患者血清、T细胞、PBMC中观察到了circRNA的差异表达，但各项研究中观察到的circRNA种类并不十分一致，可能跟疾病复杂程度有关，也可能跟分析灵敏度有关。

3.2类风湿关节炎（RA)

在RA的研究中，外周血或PBMC可见多达几十种circRNA表达差异，Yang等人用RNA-seq分析了4例RA及3例对照PBMC，发现71种circRNA差异表达，41种上调，30种下调，基因聚类分析发现大多数差异表达的circRNA与炎症及转录活性有关，qRT-PCR验证了hsa＿circ＿0000396和hsa＿circ＿0130438的下调[29]。Luo及Ouyang的研究发现RA患者hsa＿circ＿0044235显著降低[30],circRNA(092516、003524、103047、104871、101873）显著升高[31]，但与C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）、类风湿因子（RF）、anti-citrullinatedproteinantibodies(ACPA）及疾病活动性（DAS28）等无相关性。ROC曲线显示上述hsa＿circ＿0000396、hsa＿circ＿0044235、circRNA＿104871等circRNA都对RA具有诊断价值。Tang的实验发现RA患者PBMC中ciRS-7显著升高，同时ciRS-7、miR-7、mTOR存在明显的相互作用[32]。RA患者外周血中异常表达的circRNA还有hsa＿circRNA＿104194、hsa＿circRNA＿104593、hsa＿circRNA＿103334、hsa＿circRNA＿101407、hsa＿circRNA＿102594等[33]。在组织及关节液中，Wang的研究发现has-circ-0001859在关节滑液中检测出，并且通过miR204/211-ATF1调控关节腔炎症[34]。Li等人对GEO数据库挖掘筛选出关节组织中特异表达的基因位点，功能富集计算circRNAs-miRNAs-mRNAs交互作用图，并经基因敲减功能实验发现29种差异表达的circRNA与RA相关，其中沉默hsa＿circ＿0001859后可通过miR-204/211抑制SW982细胞的ATF2表达及降低炎症反应[35]。Hu在类风湿并发的心房颤动（atrialfibrillation,AF）患者心房组织中发现108种circRNA差异表达，51种上调，57种下调，GeneOntology(GO）和KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG）分析发现circRNA19591、circRNA19596、circRNA16175分别作用于36、28和18种miRNA，其中miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p与12种下调的circRNA相关[36]。

3.3原发性干燥综合征（pSS)

Su的实验分析了包含各5例样本的pSS、SLE和对照组PBMC，发现pSS差异表达234种circRNA，并且验证了筛选出的hsa＿circRNA＿001264、hsa＿circRNA＿104121、hsa＿circRNA＿045355、hsa＿circRNA＿103461、hsa＿circRNA＿105034。hsa＿circRNA＿001264、hsa＿circRNA＿104121、hsa＿circRNA＿045355与临床表现、实验室指标、疾病程度相关。早期pSS患者hsa＿circRNA＿001264明显高于长期患者，在pSS并发肾病、关节炎患者中高于无并发症患者，hsa＿circRNA＿045355变化则相反。ANA、anti-SSA、anti-SSB等抗体阳性的患者hsa＿circRNA＿001264、hsa＿circRNA＿104121更高，anti-SSA阳性患者hsa＿circRNA＿045355更低，hsa＿circRNA＿001264、hsa＿circRNA＿104121与SSDAI指数强烈相关，hsa＿circRNA＿001264同时与ESR相关，hsa＿circRNA＿045355则与SSDAI负相关。生物信息分析发现hsa＿circRNA＿001264潜在的作用靶点包括hsa-miR-18a-3p、-607、-632、-654-3p、-10b-3p等。hsa＿circRNA＿001264和hsa-miR-18a-3p的序列相关分析发现，hsa＿circRNA＿00126472-76位核苷酸与基因ST6GALNAC35'末端吻合，而这些序列正好是miR-18a-3p的种植区域（seedregion)[37]。

3.4多发性硬化（MS)

多发性硬化是免疫介导的神经系统脱髓鞘疾病，是20～40岁成年人中非创伤性神经损伤的主要因素。Iparraguirre分析了4对疾病与对照组样本外周血中13617种circRNA，共有406种差异表达，其中324种下调，82种上调，层聚分析显示circRNA表达谱可以区分疾病和对照样本，并验证了升高最明显的5种（circ＿0000518、circ＿0000517、circ＿0000519、circ＿0000520、circ＿0001400）和降低最明显的4种（circ＿0056731,circ＿0005402,circ＿0024892,circ＿0035560),ROC曲线显示circ＿0005402面积0.899，敏感度94.4%，特异度75.0%,circ＿0035560面积0.706，敏感度55%，特异度88.9%，提示二者可以作为MS标志物[38]。Cardamone在对GSDMB基因（编码GasderminB）替代剪接体（alternativesplicing）多样性的分析中发现由第5和第4外显子反向剪接而成的ecircRNA在MS患者PBMC中的表达量是对照组的2.8倍，提示GSDMBecircRNA在MS中具有一定的作用[39]。Shaker的研究发现替代剪接的调控分子MALAT1缺失时可构建MS细胞模型，该模型中存在49种circRNA差异表达，提示MALAT1可能跟MS时circRNA差异表达有关[40]。

3.5银屑病（psoriasis)

Liu通过RNA测序和qRT-PCR检测了银屑病皮损circRNA表达，共检测到6323种circRNA，其中129种circRNA差异表达，GO分析显示15种circRNA及与之有关的22种miRNA交互作用与MAPK、Ras等通路有关[41]。Qiao用微阵列方法同样观察到银屑病皮损存在4956种circRNA差异表达，其中6种circRNA相关联的MRE达到4405种，其中hsa＿circ＿0061012最相关的MRE为hsa-miR-7157-5p、hsa-miR-4769-3p、hsamiR-6817-5p、hsa-miR-4310、hsa-miR-68823p[42]。

4、其他自身免疫病

4.1克罗恩病（Crohn)

Crohn病是多种因素引起的慢性反复发作的胃肠道炎症反应，Yin对5对CD及对照样本PBMC经微阵列及qRT-PCR分析发现155种上调和229种下调的circRNA,4种circRNA(092520、102610、004662、103124）经qRT-PCR确认在CD样本中升高，上述4种circRNA在CD诊断中的ROC面积分别为0.66、0.78、0.85、0.74。进一步的比较发现circRNA＿004662在CD组织中高于溃疡性结肠炎，circRNA-miRNA-mRNA网络模型预测circRNA＿004662与mTOR(mammaliantargetofrapamycin）通路调控有关[43]。

4.2桥本氏甲状腺炎（HT)

Xiong对5对HT和对照样本外周血样本测序鉴定出627种circRNA差异表达，其中370种上调，257种下调，hsa＿circ＿0089172上调并与血清标志物甲状腺过氧化物酶抗体正相关，具有2个miR-125a-3p结合序列，HT患者miR-125a-3p下调，并与hsa＿circ＿0089172负相关，体外实验敲减hsa＿circ＿0089172可上调miR-125a-3p,ROC曲线面积为0.673[44]。

4.3原发性胆汁性胆管炎（PBC)

Zheng分析了6对PBC与对照样本的血浆发现18种上调，4种下调的circRNA，并经qRT-PCR验证了上调的hsa＿circ＿402458、hsa＿circ＿087631、hsa＿circ＿406329和下调的hsa＿circ＿407176、hsa＿circ＿082319。尤其是未经UDCA(ursodeoxycholicacid）治疗的PBC患者hsa＿circ＿402458表达上调。hsa＿circ＿402458对于PBC诊断的ROC曲线面积为0.710，预测hsa＿circ＿402458的miRNA靶点为hsamiR-522-3p和hsa-miR-943[45]。

5、小结与展望

目前已有多项研究观察到了自身免疫疾病中circRNA的差异表达情况，在疾病诊断、分层、预后中具有一定应用价值，但在同类疾病中，不同研究组鉴定出的circRNA一致性较低，更灵敏的测序及分析手段将有助于减少鉴定过程中的差异。另外，目前的研究涉及机制的不多，更多机制研究讲有助于更好地理解circRNA在自身免疫疾病中的作用。

文章来源：胡锦辉.CircRNA在自身免疫疾病中的研究进展[J].免疫学杂志,2021,37(07):639-644.