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美洲大蠊多肽PAP-2对Balb/c裸鼠肝癌原位移植瘤缺氧微环境的影响

2023-07-21 135 上传者：管理员

摘要：探讨美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌缺氧微环境的影响，及其作用机制。方法 BALb/c裸鼠用腋下接种HepG2肝癌细胞的方法构建肝癌原位移植瘤模型。将造模成功的裸小鼠随机分为模型组、阳性对照组(20 mg•kg-1 5-氟尿嘧啶)、CⅡ-3组(200 mg•kg-1美洲大蠊提取物CⅡ-3)、脱脂膏组(200 mg•kg-1美洲大蠊脱脂膏)和低、中、高剂量PAP-2组(50、100和200 mg•kg-1美洲大蠊多肽PAP-2)及低、中、高剂量联合组(20 mg•kg-1 5-氟尿嘧啶+50、100和200 mg•kg-1美洲大蠊多肽PAP-2),每组10只。各组小鼠均按0.1 mL•10 g-1的剂量腹腔注射给药，除模型组和阳性对照组隔天1次外，其余各组每天1次，共计10 d。检测裸鼠移植瘤的抑瘤率和脏器指数，用实时荧光定量聚合酶链反应法检测肿瘤组织中缺氧诱导因子(HIF-1α)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达水平。结果高剂量PAP-2组、高剂量联合组、CⅡ-3组、脱脂膏组和阳性对照组的抑瘤率分别为62.19%、78.07%、52.14%、51.11%和53.73%。高剂量PAP-2组、高剂量联合组、CⅡ-3组、脱脂膏组、阳性对照组和模型组的脾指数分别为(129.98±3.97)、(139.98±14.18)、(66.48±6.93)、(64.90±5.31)、(108.61±11.32)和(45.47±6.42)mg•g-1,肝指数分别为(843.10±59.41)、(1 112.62±37.28)、(720.68±77.70)、(709.77±51.80)、(927.66±69.19)和(497.21±59.81)mg•g-1,HIF-1α mRNA表达量分别0.96±0.09、0.55±0.22、0.97±0.29、0.86±0.22、0.88±0.32和1.28±0.22,VEGF mRNA表达量分别为0.75±0.29、0.23±0.07、0.84±0.18、0.90±0.21、0.69±0.21和1.12±0.12。高剂量联合组、高剂量PAP-2组、CⅡ-3组、脱脂膏组和阳性对照组的上述指标与模型组比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论美洲大蠊多肽PAP-2通过抑制相关血管生成因子的表达水平，抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞迁移，改善肝癌缺氧微环境。

关键词：
原位移植瘤
缺氧微环境
美洲大蠊多肽PAP-2
肝癌
血管内皮生长因子
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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种典型的血管丰富且恶性程度极高的肿瘤。肿瘤血管生成是与肿瘤微环境息息相关的生物学过程[1]。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是与肿瘤和血管相关的特异性标志物，其在肿瘤组织表达水平越高，越可能促进肿瘤侵袭与转移，预后越差[2,3]。美洲大蠊(Periplaneta Americana)俗称“蟑螂”,入药初见于《神农本草经》[4],其对烧烫伤、急慢性心力衰竭和乙型病毒性肝炎等均有一定的治疗效果，且其小分子肽PAP-2具有一定的抗肿瘤作用[5]。本研究通过构建裸鼠肝癌移植瘤模型，旨在明确美洲大蠊多肽PAP-2是否通过调控肝癌微环境中HIF-1α和VEGF的表达，进而抑制肿瘤生长。

一、材料与方法

1、材料

动物SPF级BALb/c雄性裸小鼠，体质量18～22 g,鼠龄6～8周，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。动物许可证号：SCXK(湘)2016-0002。本实验经大理大学实验动物伦理委员会批准(伦理批号：20150309)。

细胞株人肝癌HepG2细胞株，购自上海生科院细胞库。

药品与试剂美洲大蠊多肽PAP-2,含量：98.057%,批号：P14805-20171023,美洲大蠊提取物CⅡ-3,含量：0.2%,批号：17102125,美洲大蠊脱脂膏，含量：75.18%,批号：17102125,均由大理大学张成桂博士提供；5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU),含量：99%,批号：WXBC2167V,美国Sigma公司生产。小鼠VEGF酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒，美国NOVUS公司生产；HIF-1α、VEGF受体2(VEGF receptor 2, VEGFR2)抗体，均由美国Cell Signaling Technology公司生产；VEGF抗体，美国R&D Systems公司生产。

仪器7500荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪，美国应用生物公司产品；POLARstar Omega酶标仪，德国BMG labtech公司产品。

2、实验方法

2.1溶液配制

取适量的美洲大蠊多肽PAP-2、美洲大蠊提取物CⅡ-3、美洲大蠊脱脂膏和5-FU,用0.9%NaCl配制成质量浓度均为20 mg·mL-1的母液，置于4℃冰箱保存，备用。

2.2细胞培养与染色

常规培养肝癌HepG2细胞至第3代后，在显微镜下进行细胞计数，用锥虫蓝染色观察细胞活力。

2.3模型建立[6]6]

在裸小鼠腋窝右侧皮下注射HepG2细胞悬液(1×107 cell·mL-1)0.2 mL。待第10天左右，裸小鼠皮下长出瘤块后，颈椎脱位处死，取出瘤块，剪成相同大小的瘤块。在BALb/c小鼠剑突正下方切出长约1 cm纵断面小切口，挤压出肝左叶，用带线缝合针穿过瘤块将其放置在原位组小鼠肝左叶用针划出的小口内，将小鼠肝轻轻推回腹腔，缝合伤口，即构建了BALb/c小鼠肝癌的原位移植瘤模型，放回鼠笼，监测移植位置肿瘤生长情况，肿瘤直径至10 mm时提示肿瘤建模成功。

2.4动物分组与给药方法

将造模成功的裸小鼠随机分为模型组、阳性对照组(20 mg·kg-1 5-FU)、CⅡ-3组(200 mg·kg-1美洲大蠊提取物CⅡ-3)、脱脂膏组(200 mg·kg-1美洲大蠊脱脂膏)和低、中、高剂量PAP-2组(50、100和200 mg·kg-1美洲大蠊多肽PAP-2)及低、中、高剂量联合组(20 mg·kg-1 5-FU+50、100和200 mg·kg-1美洲大蠊多肽PAP-2),每组10只。各组小鼠均按0.1 mL·10 g-1的剂量腹腔注射给药，除模型组和阳性对照组隔天1次外，其余各组每天1次，共计10 d。

2.5样本采集

实验期间，观察各组小鼠的一般状况，包括饮食、皮毛、体质量和行动是否敏捷等。实验结束次日，眼眶取血后，处死动物，并取肝及肝内肿瘤和脾。

2.6测定裸鼠抑瘤率及脏器指数[7]7]

洗去小鼠脏器和肿瘤上的血渍，用滤纸吸干残留的水分，进行称重记录并拍照存档。肿瘤抑制率(%)=(模型组瘤质量-给药组瘤质量)/模型组瘤质量×100%,脏器指数=脏器质量(mg)/体质量(g)×10。同时，计算联合用药Q值，以评价PAP-2联用5-FU后的增效情况。Q值=E(a+b)/(Ea+Eb-Ea×Eb)。其中，E(a+b)表示5-FU和PAP-2联合后的抑瘤率，Ea、Eb表示5-FU及PAP-2单独用后的抑瘤率。两药合用具有拮抗、相加及协同作用分别用Q≤0.85、0.85<Q≤1.25和Q>1.25表示。

2.7用ELISA法检测裸鼠外周血清VEGF含量[8]8]

将全血于4℃下放置2 h,然后在4℃下，以4 000 r·min-1离心15 min,吸取上清液，置于-20℃保存，备用。按试剂盒说明书步骤进行血清VEGF含量的检测，最后用ELISA Calc软件对实验数据进行分析。

2.8用实时荧光定量PCR法检测裸鼠肿瘤组织中HIF-1α和VEGF mRNA含量[8]8]

瘤块组织放于冰块上，加入Trizol 0.5 mL,将组织匀碎，室温消化10 min,提取分离mRNA,并测定RNA浓度。取总RNA按照逆转录反应体系逆转录成模板cDNA。将cDNA置于PCR仪上进行PCR扩增反应。严格按照说明书步骤进行操作，以β-actin为内参，检测各组HIF-1α及VEGF mRNA的变化。

2.9用蛋白质印迹法检测裸鼠肿瘤组织中HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白的表达水平[9]9]

首先提取各组肿瘤组织蛋白，测定蛋白浓度，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、洗膜、抗体孵育等系列处理，最后开展蛋白质的化学发光检测和扫胶片。以β-actin为内参，用Image J软件对蛋白条带进行灰度分析。

3、统计学处理

用SPSS 17.0软件进行统计分析。实验数据用x¯±s表示，组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1一般状况

低、中、高剂量PAP-2组分别给予50、100和200 mg·kg-1美洲大蠊多肽PAP-2;低、中、高剂量联合组分别给予20 mg·kg-1 5-FU+50、100和200 mg·kg-1美洲大蠊多肽PAP-2;脱脂膏组给予200 mg·kg-1美洲大蠊脱脂膏；CⅡ-3组给予200 mg·kg-1美洲大蠊提取物CⅡ-3;阳性对照组给予20 mg·kg-1 5-FU;模型组给予0.9%NaCl。

接种第4～6天，裸鼠腋下有瘤块突出；接种第8天，小鼠腋下瘤块直径可达到1～2 cm。随着给药时间的推移，模型组裸鼠出现明显厌食、皮毛不顺、少动，各给药组裸鼠行动较为敏捷，饮食较佳，且低、中、高剂量PAP-2组小鼠状态均显著优于CⅡ-3组和脱脂膏组。

2美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌原位移植瘤裸鼠的抑瘤作用及对脏器指数的影响

与模型组相比，各给药组均能够抑制肝癌原位移植瘤裸鼠肿瘤的生长，瘤重及抑瘤率均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与阳性对照组相比，高剂量联合组的抑瘤作用更明显，差异有统计学意义(P<0.05)。PAP-2的抑制作用呈剂量依赖性，高剂量联合组呈相加或协同作用(Q>0.85),抑瘤效果最好，而CⅡ-3组及脱脂膏组的抑瘤效果与高剂量PAP-2组相比，差异均无统计学意义(均P>0.05)。与模型组相比，各给药组裸鼠的脾指数和肝指数均提高，具有一定的量效关系，对脾指数的提高除低剂量PAP-2组外，差异均有统计学意义(均P<0.05),肝指数的提高则各组差异均有统计学意义(均P<0.05)。与CⅡ-3组及脱脂膏组相比，高剂量PAP-2组对脏器指数的提高更为显著，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表1。

3美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌原位移植瘤裸鼠外周血清中VEGF的影响

模型组、阳性对照组、CII-3组、脱脂膏组和低、中、高剂量PAP-2组及低、中、高剂量联合组的血清中VEGF含量分别为(71.09±2.34)、(49.31±2.65)、(65.49±1.07)、(63.86±1.38)、(61.89±2.90)、(62.81±1.33)、(60.82±1.09)、(61.57±4.77)、(60.26±4.45)和(57.94±1.47)pg·mL-1。与模型组比较，各给药组均能够降低血清中VEGF含量，差异均有统计学意义(均P<0.05),且有一定的剂量依赖性。与CⅡ-3组和脱脂膏组相比，高剂量PAP-2组的VEGF含量有所下降，但差异均无统计学意义(均P>0.05),说明美洲大蠊多肽PAP-2、CⅡ-3和脱脂膏降低VEGF的作用相当。

4美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌原位移植瘤裸鼠肿瘤组织中HIF-1α和VEGF mRNA水平的影响

与模型组相比，除高剂量PAP-2组和低剂量联合组外，其余各给药组裸鼠的肿瘤组织中HIF-1αmRNA表达量均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05);与模型组相比，除低、中剂量PAP-2组和脱脂膏组外，其余各给药组的VEGF mRNA表达量均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与高剂量PAP-2组、阳性对照组和模型组比较，高剂量联合组的HIF-1α和VEGF mRNA表达量均显著降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。

5美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌原位移植瘤裸鼠肿瘤组织中HIF-1α、VEGF和VEGFR2蛋白水平的影响

与模型组相比，除脱脂膏组外，其余各给药组的HIF-1α蛋白相对表达水平均显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与模型组相比，高剂量PAP-2组的VEGF蛋白相对表达水平显著下降，中、高剂量联合组的VEGFR2蛋白相对表达水平均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。高剂量PAP-2组下调HIF-1α和VEGF蛋白表达的作用均明显优于CⅡ-3组和脱脂膏组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。

表1美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌原位移植瘤裸鼠脾指数和肝指数的影响(x¯±s)

表2美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌原位移植瘤裸鼠肿瘤组织中缺氧诱导因子(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达量及HIF-1α、VEGF、VEGF受体2(VEGFR2)蛋白水平的影响(x¯±s)

三、讨论

VEGF和HIF-1α诱导血管生成的能力较强，在肿瘤的转移和复发中发挥重要作用[10]。在有氧条件下，HIF-1α可以通过羟化以及与泛素连接酶结合在体内降解；在缺氧条件下，HIF-1α不能有效地羟化，从而在体内积累，参与多种恶性肿瘤的基因转录[11]。同时，HIF-1α还能对VEGF的转录起直接促进作用，通过增加VEGF mRNA的稳定性来促进肿瘤的侵袭和转移[12]。因此，要实现对肿瘤细胞的抑制，就要使肿瘤组织中与微环境相关的血管生成因子下调。

本研究结果发现，美洲大蠊多肽PAP-2可抑制肝癌原位移植瘤裸鼠的瘤块生长，并改善其脾指数和肝指数，且给药剂量越大，抑制作用越强。同时，美洲大蠊多肽多肽PAP-2在一定程度上可降低肿瘤组织中HIF-1α、VEGF和VEGFR2的表达水平，且剂量越大，其下调作用越明显，呈剂量依赖关系；但在降低血清中VEGF含量方面，CⅡ-3及脱脂膏与美洲大蠊多肽PAP-2的作用相差不大。此外，美洲大蠊多肽多肽PAP-2与5-FU联用后具有效果增强的协同或相加作用，抑瘤效果比单用美洲大蠊CⅡ-3和脱脂膏更好。

因此，美洲大蠊多肽PAP-2抗HCC机制可能与下调血管生成因子、抑制肿瘤血管生成、抑制肿瘤细胞迁移、改善缺氧微环境有关。

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