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酶解法与乙醇渗漉法制备颠茄流浸膏的比较研究

2023-07-21 231 上传者：管理员

摘要： 比较研究酶解法与乙醇渗漉法提取颠茄草有效成分的提取效率。方法采用酶解法对颠茄草进行提取，筛选纤维素酶、淀粉酶、果胶酶和植物提取复合酶，用高效液相色谱法(HPLC)测定颠茄流浸膏中硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的含量，以乙醇渗漉法为对照，比较2种方法的提取效果。结果筛选出植物提取复合酶为最适酶，采用植物提取复合酶的酶解法提取硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的收率分别为95.57%和94.50%,乙醇渗漉法提取硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的收率分别为85.43%和85.98%,酶解法提取收率优于乙醇渗漉法。结论酶解法制备颠茄流浸膏的提取效率优于乙醇渗漉法，且适用于不同产地的颠茄草，可降低成本，对提升颠茄流浸膏的制备工艺有一定价值。

关键词：
东莨菪内酯
乙醇渗漉法
硫酸天仙子胺
酶解法
颠茄流浸膏
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颠茄流浸膏是中国较广泛使用的植物中间体，具有解除平滑肌痉挛，抑制腺体分泌等功效；临床上主要用于胃十二指肠溃疡，胃肠道、肾、胆绞痛等[1]。目前，颠茄流浸膏的制备主要是通过乙醇进行渗漉，该制备工艺耗时长，消耗溶剂大，对有效成分富集不充分。颠茄流浸膏主要含天仙子胺、东莨菪碱等莨菪类生物碱成分，该类物质高温均易分解，提取条件更为温和的生物酶提取法对于该类生物碱成分的提取效果良好[2]。为了高效制备颠茄流浸膏，同时提高颠茄流浸膏的品质，降低成本，缩短时间，利用生物酶进行酶解[3],破坏药材细胞壁，使有效成分能够快速溶出。本实验利用多种酶进行提取，与乙醇浸泡渗漉法对照，比较2种方法的硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的提取效果，并以各产地颠茄草来考察生物酶的适用性。

1、仪器材料与方法

1.1仪器与材料

玻璃渗漉筒(泰兴市博泰实验仪器厂9 cm×160 cm),高效液相色谱仪(美国安捷伦agilent 1260 infinity),分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司BT25S,精密度0.01 mg),电子天平(瑞安市英衡电器有限公司YH-A 20001),pH计(上海雷磁),颠茄草(石药集团江西金芙蓉药业股份有限公司提供),硫酸天仙子胺对照品(中国食品药品检定研究院批号11982-202103),东莨菪内酯对照品(中国食品药品检定研究院批号110768-202105),甲醇、乙腈为色谱纯，十二烷基磺酸钠为分析纯，水为纯化水，纤维素酶、淀粉酶、果胶酶、植物提取复合酶(泰安兴得利生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1酶溶液的制备

取上述纤维素酶0.2 g加纯化水600 ml,充分搅匀，用10%的盐酸调溶液pH值至4.8,静置保温50℃备用。取果胶酶0.2 g加纯化水600 ml,充分搅匀，用10%的盐酸调溶液pH值至3.5,静置保温50℃备用。取淀粉酶0.2 g,充分搅匀，加纯化水600 ml用10%的盐酸调溶液pH值至5.0,静置备用。取植物提取复合酶0.2 g加纯化水600 ml,充分搅匀，用10%的盐酸调溶液pH值至4.5,静置保温50℃备用。

1.2.2酶提取液的制备

取自整株新疆颠茄草烘干粉碎过3号筛，精密称取100 g药材粉末4份，分别加入4个玻璃渗漉筒内，编号1号、2号、3号、4号，在1号渗漉筒内加入纤维素酶溶液，在2号渗漉筒内加入果胶酶溶液，在3号渗漉筒内加入淀粉酶溶液，在4号渗漉筒内加入植物提取复合酶溶液，上述酶液面均没过药材。酶解提取颠茄草的过程温度均控制在40～50℃,浸泡6 h后，均以1 ml·min-1的流速收集漉液，至漉液不再流出，收集全部的渗漉液。将1号、2号、3号、4号的渗漉液摇匀，分别精密量取体积438 ml, 440 ml, 425 ml, 450 ml。分别精密量取上述4种酶漉液50 ml置蒸发皿中蒸干，用50%甲醇溶解，转移至25 ml容量瓶中，定容，摇匀，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得1号样品溶液、2号样品溶液、3号样品溶液、4号样品溶液。

1.2.3醇渗漉液的制备

精密称取上述同批次颠茄草粉末100 g,加入玻璃渗漉筒内，加入药材量6倍85%乙醇密闭浸泡48 h,以1 ml·min-1的流速进行渗漉，该渗漉过程控制在30℃,收集漉液450 ml。取漉液用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得醇渗漉溶液样品。

1.2.4空白溶液的制备

精密称取上述各4种酶溶液，按照酶漉液的方法制备即得。

1.2.5对照品溶液的制备

精密称取硫酸天仙子胺对照品适量，加50%甲醇制成240.0μg·ml-1的对照品溶液。标准溶液：精密称定东莨菪内酯适量，50%甲醇制成15.3μg·ml-1的对照品溶液。

2、结果

2.1色谱条件及适用性考察

硫酸天仙子胺色谱条件：安捷伦C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5μm),流动相用乙腈：0.25%十二烷基磺酸钠的0.004%磷酸溶液(40∶60),等度洗脱，流速1.0 ml·min-1,检测波长210 nm,柱温40℃,进样量10μl;东莨菪内酯色谱条件：Ultimate XB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm);流动相：A为甲醇，B为0.05%磷酸溶液，梯度洗脱(0～5 min, 3%～15%A;5～60 min, 15%～60% A)流速1.0 ml·min-1,检测波长344 nm,柱温35℃,进样量10μl。将各溶液分别按照上述色谱条件进样3次，记录各样品溶液的色谱图和峰面积值[4]。结果表明对照品溶液和供试品溶液在相应的时间均有色谱峰出现，空白溶液没有相应色谱峰的出现，说明该方法适用于各组提取液中天仙子胺和东莨菪内酯的含量测定。见图1、图2。

2.2方法学验证

2.2.1线性关系考察

精密称取硫酸天仙子胺对照品，用50%甲醇制成240.0、480.0、960.0、1920.0、3840.0、7680.0μg·ml-1标准溶液；精密称定东莨菪内酯对照品，用50%甲醇制成15.3、30.6、61.2、122.4、244.8、489.6μg·ml-1标准溶液。分别吸取上述标准溶液在“2.2.1”色谱条件下进样，以峰面积为纵坐标(Y),以标准溶液浓度为横坐标(X)进行回归，得回归方程。见表1。

表1硫酸天仙子胺东莨菪内酯的线性范围

2.2.2精密度实验

分别精密吸取硫酸天仙子胺和东莨菪内酯对照品溶液10μl,在“2.2.1”项色谱条件下连续进样6次，测得硫酸天仙子胺和东莨菪内酯峰面积RSD值为0.38%,0.29%,表明仪器精密度良好。

2.2.3重复性实验

按照“1.2.2”项酶解法制备1号样品溶液5份，在“2.1”项色谱条件下进样，得到硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量RSD值分别为0.83%,0.97%,表明该方法重复性良好。

2.2.4稳定性实验

取“2.2.3”中的制备的同一份供试品溶液，分别在0、0.5、1、2、4、8、16、24 h取样，在“2.1”项色谱条件下进样分析，测得硫酸天仙子胺和东莨菪内酯峰面积RSD值分别为1.02%,1.21%,表明供试品溶液在24 h内稳定。

图1天仙子胺HPLC色谱图

图2东莨菪内酯HPLC色谱图

2.2.5加样回收率实验

精密称取已知含量的颠茄草粉末100 g,共9份，每组3份，分别按照样品含量的80%、100%、120%加入适量对照品，按照“1.2.2”项1号纤维素酶渗漉法制备溶液，在“2.1”项色谱条件下测定硫酸天仙子胺和东莨菪内酯含量，计算加样回收率。见表2。

2.3含量测定

取“1.2”项下的酶提取液和乙醇漉液在“2.1”项的色谱条件下测定硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的含量，发现4种酶提取收率差异较大，以植物提取复合酶为最适酶，其天仙子胺和东莨菪内酯的提取收率均最高，明显高于其他3种酶。因此，选择植物提取复合酶作为酶解法的水解用酶，提取颠茄草中的天仙子胺和东莨菪内酯的收率，和乙醇渗漉法相比，2种有效成分的提取收率高约10%,优于乙醇渗漉法。见表3。

2.4不同产地颠茄草的酶解法提取验证

精密称取500 g已知含量的不同产地颠茄草各3份粉碎过3号筛，利用植物提取复合酶按照“1.2”项下提取，制备不同的提取液，在“2.1”项的色谱条件下进样，测得硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的含量，计算硫酸天仙子胺和东莨菪内酯的渗漉收率，发现提取收率均较好。见表4。

表2硫酸天仙子胺东莨菪内酯加样回收率测定结果

表3 2种提取方法的提取收率

表4植物提取复合酶对各不同产地颠茄草的渗漉收率

3、讨论

酶是以蛋白质形式存在的生物催化剂，在适当的pH值、温度下具有较高活性。植物细胞壁中含有90%多糖、10%左右的蛋白质、酶类及脂肪酸，细胞壁中的多糖主要是纤维素、半纤维素和果胶类[5]。常用的破壁的酶制剂有果胶酶、纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶等。由于植物细胞壁的这种结构组成，单一的水解酶水解效果有限，本研究中选用的植物提取酶是一种复合酶，结合纤维素酶、果胶酶、淀粉酶和木聚糖酶4种酶，共同破坏细胞壁，将纤维素、果胶等大分子链通过水解作用切断，有利于小分子肽、多糖、生物碱的浸出，酶解后有效成分浸出率高[6]。在相同的酶解温度和酶解时间条件下，植物提取复合酶提取颠茄草中的天仙子胺和东莨菪内酯的收率最高，酶的加量和酶解条件尚需进一步优化，确定最佳的酶解工艺。

以植物提取复合酶为提取介质的酶解提取方法，同传统的乙醇渗漉法比较，东莨菪内酯的HPLC图谱中，乙醇渗漉液的主要特征峰有11个，酶解液的主要特征峰有16个，提取液中的成分种类有所增加，多出的特征峰的出峰时间较早，推测为一些极性较大的组分，酶的水解作用，减少了传递阻力，增大了极性组分的溶出。

乙醇渗漉法的提取时间通常在48 h以上，操作较为繁杂，且需要使用大量的乙醇溶剂。与乙醇渗漉法相比，酶解法作用条件温和，24 h内即可完成提取操作，尤其适合于热敏性物质的提取，对于硫酸天仙子胺和东莨菪内酯这2种颠茄草的有效成分，其提取收率均达到了90%以上，表明酶解利于此类生物碱的溶出。本研究还同时考察不同产地的颠茄草采用酶解法提取，发现提取效果均良好，说明酶解法适合用于颠茄草的提取。

参考文献:

[1]张婷,高杰,岳超,等HPLC法同时测定颠茄片5个指标成分含量及特征图谱分析[J]药物分析杂志,2014,34(12):2154-2159.

[2]陈芳,常明泉酶渗漉与醇渗漉提取颠茄草中茛菪碱的效果比较[J]儿科药学杂志,2016, 12(12):47-49.

[3]潘涛,陈芳,常明泉.仿生酶解法提取颠茄草的研究[J]现代医药卫生,2017 ,33(6):830-832.

[4]冯言颜,熊维政,李磊,等多阶段采样分析颠茄草特征成分变化规律及最佳采收期[J]医药导报,2022 ,41(9).1354-1359.

[5]赵庆新,袁生植物细胞壁研究进展[J]生物学通报,2007,42(7):8-9.

[6]金湛,朱英,程榆平,等酶解提取红花中脱水红花黄色素B工艺的优化[J].中成药,2016,38(7):1640-1643.

基金资助:九江市重点研发计划项目(No.S2020ZDYFG021);

文章来源:赵明,刘平霞,胡丽晖等.酶解法与乙醇渗漉法制备颠茄流浸膏的比较研究[J].光明中医,2023,38(14):2722-2726.