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细胞周期蛋白B1在肝细胞癌中的表达及其临床研究

2023-08-10 220 上传者：管理员

摘要：研究细胞周期蛋白B1(cyclin B1,CCNB1)在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)组织中的表达及其临床研究。方法从基因表达综合数据库(GEO)获得4个HCC相关数据集，分析HCC和正常肝组织之间的差异表达基因。从癌症基因组图谱(TCGA)数据库获得374例HCC患者的临床数据及基因表达谱，验证CCNB1的表达水平。利用人类蛋白图谱(HPA)数据库分析CCNB1的蛋白表达水平。Kaplan-Meier plotter数据库评估CCNB1对肝癌患者的预后价值。用单因素及多因素Cox回归分析影响HCC患者总生存期(OS)的危险因素。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，并计算曲线下面积(AUC)评估CCNB1表达的诊断价值。结果 CCNB1在HCC组织中高表达。生存分析显示CCNB1的高水平表达与HCC患者的OS成负相关(HR=2.34,95%CI:1.55～3.54,P<0.001)。多因素Cox回归分析显示，CCNB1高表达是影响HCC患者OS的危险因素(HR=1.991,95%CI:1.252～3.168,P=0.004)。ROC曲线分析显示，CCNB1的AUC为0.980,具有较高的诊断价值。结论 CCNB1在HCC组织中高表达，并与HCC患者的预后不良相关，CCNB1可能是HCC患者诊断和预后评估的有价值的生物学指标。

关键词：
细胞周期蛋白B1
肝细胞癌
血清甲胎蛋白
诊断价值
预后价值
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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，对人类健康和生命构成巨大威胁[1]。肝细胞癌的特点是发病隐匿，早期症状不明显，发展迅速，预后差[2,3]。几十年来，血清甲胎蛋白(AFP)作为HCC的特异性肿瘤检测标志物在临床诊断中被广泛应用，然而有30%～40%的HCC患者为AFP阴性，仅使用AFP检测HCC有一定的漏诊率[4,5]。目前，射频微波消融、手术切除、免疫检查点抑制剂、原位肝移植等在HCC治疗方面已经取得了进展，但由于HCC患者的复发转移率高，预后仍不理想[6,7]。因此，为了有效诊断和治疗，延长患者生存时间，改善预后，迫切需要寻找准确和有效的诊断和预后生物标志物。

CCNB1是启动有丝分裂的关键分子，位于人类染色体5q12上，与细胞周期密切相关，在控制细胞周期的G1/S向G1/M的转变中发挥重要作用[8]。研究表明，CCNB1在多种肿瘤中高表达，且与肿瘤细胞的生长、分化、凋亡和转移密切相关。一项乳腺癌的研究发现CCNB1在乳腺癌组织表达高于正常乳腺组织，其高表达促进癌细胞增殖[9]。在宫颈鳞状细胞癌中的研究发现转录因子叉头框蛋白M1(FOXM1),通过抑制P53途径的激活促进CCNB1的转录，导致宫颈鳞状细胞癌细胞的生长和细胞周期进展[10]。同时CCNB1在胰腺癌中高表达，沉默CCNB1基因可明显抑制癌细胞增殖能力[11]。本研究利用公共数据库分析了CCNB1在肝癌中的表达，利用TCGA数据库、HPA数据库、Kaplan-Meier数据库和ROC曲线验证了CCNB1在HCC中的重要作用，为进一步临床试验研究提供有效的生物标志物候选者。

1、资料与方法

1.1资料

GEO数据库、TCGA数据库、HPA数据库、Kaplan-Meier plotter数据库。

1.2方法

1.2.1 GEO数据库分析

本研究中使用的4个肝细胞癌相关基因表达微阵列数据集从基因表达综合数据库(GEO)中下载，分别是GSE54236、GSE62232、GSE101685和GSE112790,其中GSE54236基于GPL6480平台，GSE62232、GSE101685和GSE112790基于GPL570平台。使GEO2R筛选来自HCC患者的肿瘤和非肿瘤样本之间的差异基因。筛选条件为校正P<0.05和|logFC|≥1,即校正P<0.05且logFC≥1的差异基因为上调基因，校正P<0.05且logFC≤-1的差异基因为下调基因。通过维恩图进行计算和图形化4个数据集之间的重叠差异基因。

1.2.2 TCGA数据库分析

从癌症基因组图谱(TCGA)数据库获得374例HCC患者的临床数据及基因表达谱，其中包括50对配对的肝癌组织和癌旁组织。比较肝癌组织与配对癌旁组织及非配对肝组织中CCNB1的表达差异。

1.2.3 HPA数据库分析

用人类蛋白图谱(HPA)数据库分析CCNB1蛋白在正常组织和肝癌组织的表达差异。

1.2.4 Kaplan-Meier plotter数据库分析

Kaplan-Meier plotter数据库是一个用于在线分析的网络数据库，它能够评估54 000个基因对21种肿瘤类型生存的影响。本研究使用Kaplan-Meier plotter数据库在线分析评估CCNBI对肝癌患者的预后价值。为明确CCNB1在HCC中的诊断价值，对TCGA数据库的临床信息进行ROC分析。

1.3统计学处理

用SPSS 21.0、R 3.6.3和GraphPad Prism 5软件进行数据统计分析。采用独立样本t检验分析GEO、TCGA数据库中HCC组织和正常组织中基因表达水平的差异。Kaplan-Meier plotter生存曲线分析采用log-rank检验，并显示为风险比(HR)、95%置信区间(95%CI)和P值。采用单因素及多因素Cox回归分析影响HCC患者总生存期的危险因素。用受试者工作(ROC)曲线下面积(AUC)评估基因对肝细胞癌的诊断价值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 GEO数据库中差异基因表达

本研究选择的4个GEO数据集中包括369个HCC样本和113个正常肝组织样本。根据筛选条件，GSE54236中共鉴定出804个差异基因，其中上调基因514个，下调基因290个。在GSE62232中鉴定出1 389个差异基因，其中772个上调基因，617个下调基因。在GSE101685数据集中，共鉴定出1 495个差异基因，其中包括650个上调基因和845个下调基因。在GSE112790中鉴定出1 616个差异基因，其中上调基因942个，下调基因674个。共筛选出224个重叠的差异基因，其中包括CCNB1、E2F8、TPX2、GPSM2等87个上调基因，及CYP26A1、CXCL14、CYP39A1、HMGCS2等137个下调基因。本研究选择上调基因CCNB1进行研究。

2.2 TCGA数据库验证CCNB1的基因表达水平

使用TCGA数据库验证肝癌患者CCNB1的基因表达水平，肝癌组织中CCNB1的表达水平高于配对癌旁肝组织或非配对的肝组织(P<0.001),见表1。

表1 CCNB1在肝癌、配对的癌旁组织和非配对的肝组织中的表达

2.3 HPA数据库分析CCNB1在肝癌中的蛋白表达

基于HPA数据库分析HCC中CCNB1蛋白表达水平，根据免疫组化染色阳性强度和阳性细胞所占比例进行综合评估。结果显示CCNB1在正常肝组织中不表达，在肝癌组织中具有较强的阳性表达和较高的阳性表达率，尤其抗体CAB003804染色12份切片，9份强阳性表达，见表2。

表2肝癌组织中CCNB1蛋白表达阳性强度和阳性表达情况(份)

2.4 CCNB1在HCC中的预后、诊断价值

CCNB1的高水平表达与HCC患者的OS成负相关(HR=2.34,95% CI: 1.55～3.54,P<0.001),见图1。对TCGA数据库的临床参数进行单因素Cox回归分析显示，高CCNB1表达与低OS相关(HR=1.741,P=0.002);多因素Cox回归分析显示，高CCNB1表达是影响HCC患者OS的危险因素(HR=1.991,P=0.004),见表3。为了分析CCNB1表达在HCC中的诊断价值，对TCGA数据库中的CCNB1基因表达的临床数据进行ROC曲线分析，结果显示ROC曲线的AUC为0.980,其最佳截断值为1.142,敏感度为0.941,特异度为0.940,提示对HCC具有较高诊断价值，见图2。

图1 CCNB1的表达与HCC患者的总生存率的关系

表3与HCC患者总生存期相关的临床参数的单因素和多因素Cox回归分析

图2 HCC组织中CCNB1表达的ROC曲线分析

3、讨论

肝癌是全球第6大最常见的癌症，也是导致癌症死亡的第4大原因[12]。肝细胞癌占原发性肝癌的85%～90%,是全球一个主要的健康问题[13]。近些年，虽然针对HCC的早期筛查、诊断和治疗取得了很大的进展，但HCC的诊断和预后生物标志物以及靶向药物尚未完全揭示。寻找与HCC发生、发展相关的分子靶点，探索HCC癌诊断、预后相关的生物标志物对于改善预后具有重要意义。

肿瘤是一种以细胞生长和增殖失控为特征的疾病[14,15,16],细胞周期紊乱是最重要的特征之一[17]。有学者认为肿瘤实质上是一类细胞周期疾病，深入研究以细胞周期相关基因为靶标的肿瘤治疗有着广阔的前景[18]。CCNB1是细胞周期蛋白家族中一个重要的成员，在促进细胞周期的G1/S向G1/M的转变中发挥重要作用[8]。CCNB1的一个重要角色是通过与细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)结合形成复合物而参与细胞增殖[19]。目标底物被CCNB1-CDK1复合物磷酸化，导致细胞周期进展[20]。越来越多研究表明许多癌组织如胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鳞状细胞癌等存在CCNB1过表达，并与预后相关[21,22,23,24]。本研究从4个HCC相关基因表达GEO微阵列数据集中筛选出224个重叠差异基因，通过TCGA数据库中配对和非配对样本以及HPA数据库验证了无论是mRNA水平还是蛋白水平，CCNB1在肝癌组织中均高表达。生存分析及多因素Cox分析提示CCNB1的高表达与HCC患者的不良预后密切相关，是影响HCC患者预后的危险因素。同时CCNB1高表达对HCC具有较高的诊断价值。Gu等[25]研究提示CCNB1在肝癌组织中的高表达与预后不良相关，RNA干扰敲除CCNB1可抑制肝癌细胞的增殖。Hao等[26]研究指出CCNB1在肝癌细胞中高表达，双氢青蒿素可降低CCNB1的表达水平，并抑制了肝癌细胞的增殖，认为CCNB1是肝癌的潜在治疗靶点。Chai等[27]研究指出，转录因子叉头框蛋白M1(FOXM1)和CCNB1在肝肿瘤组织中同时高表达，FOXM1的表达失调通过CCNB1表达的转录激活，在肝癌细胞增殖中具有重要作用，认为FOXM1/CCNB1轴可能是肝癌治疗的潜在靶点。

本研究运用全球公认的数据库平台，利用生物信息学方法对肝癌数据进行了较为深入的挖掘分析，研究结果提示CCNB1在肝癌组织中高表达，其异常表达对肝癌患者预后、诊断具有重要临床意义，CCNB1可能是HCC患者诊断和预后评估的有价值的生物学指标，同时本研究为进一步对CCNB1的致病机制研究提供了一定的线索和理论基础。

基金资助:浙江省医药卫生科技计划项目(2022KY276);

文章来源:刘斐,杨倩倩,刘春涛等.细胞周期蛋白B1在肝细胞癌中的表达及其临床研究[J].中国卫生检验杂志,2023,33(15):1812-1816.