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促进肝癌细胞迁移、侵袭及增殖

2023-10-10 127 上传者：管理员

摘要：目的:探究脂筏特征蛋白2(Flotillin2,FLOT2)对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响及相关机制。方法:通过ENCORI数据库和细胞功能学实验证实FLOT2在肝癌中的表达情况以及对肝癌细胞生物学行为的影响；TargetScan中检索可能调控FLOT2的miRNA,CancerMIRNome分析miR-148a-3p在肝癌中的表达和对肝癌患者预后的影响，qRT-PCR和Western Blot检测过表达miR-148a-3p后肝癌细胞中FLOT2的表达水平，双荧光素酶实验验证miR-148a-3p与FLOT2的靶向调控关系；将细胞分为pcDNA组、pcDNA-FLOT2组以及pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p mimics组，Transwell实验以及EdU实验检测三组细胞迁移、侵袭和增殖能力。结果:FLOT2在肝癌中高表达，高表达FLOT2的肝癌患者预后更差，过表达FLOT2增强肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力；miR-148a-3p在肝癌组织中低表达，与肝癌患者预后相关，和FLOT2呈负相关；过表达miR-148a-3p降低FLOT2的mRNA和蛋白水平，双荧光素...更多

关键词：
FLOT2
miR-148a-3p
增殖
肝癌
迁移
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肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球癌症相关死亡的第四大常见原因[1]。多数HCC确诊时已处于晚期，尽早地发现和治疗HCC,能够大大提高患者的生存率[2]。因此，寻找新的生物标志物和进一步探究可能的发病机制对于肝癌的诊断和治疗非常重要。脂筏(lipid raft)是细胞膜上直径约为10～200 nm的微小区域，包括FLOT1、FLOT2、prohibitin(PHB)等组成性蛋白，参与细胞膜运输及信号转导等诸多生理过程[3]。FLOT2在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用，如肝癌、黑色素瘤、肺癌、胃癌等[4,5,6,7]。但是，调控FLOT2基因表达的上游机制并不十分清楚。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类大小为19～22个核苷酸的非编码小RNA[8]。通常情况下，miRNA对靶基因具有负向调控作用，可以降解靶基因或抑制靶基因翻译。miRNA也与癌症的发病机制有关，充当肿瘤抑制因子或癌基因[9]。

本研究证实了高表达的FLOT2促进肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力，多种数据库筛选得到可能调控FLOT2基因的miR-148a-3p,结合细胞功能学实验发现miR-148a-3p影响肝癌细胞的生物学功能，并与FLOT2基因表达量呈负相关，双荧光素酶实验验证了miR-148a-3p与FLOT2基因的靶向调控关系。总而言之，我们的研究揭示了调控FLOT2基因影响肝癌细胞恶性生物学行为的潜在上游作用机制，为临床研究提供新的治疗靶点。

1、材料与方法

1.1材料

人肝癌五种细胞系(Huh7、HepG2、MHCC97H、SNU387、Hep3B)均来自中科院上海细胞典藏委员会；Transwell小室、细胞培养瓶、细胞培养板及培养皿、冻存管、离心管购自Corning公司；RNA提取试剂盒购自OMEGA公司；逆转录试剂盒购自Thermo公司；EdU试剂盒购自APE×BIO公司；双荧光报告基因检测系统检测盒来自上海吉玛公司；Tween-20、1.5M Tris-HCL(pH=8.8)、30%丙烯酰胺、甲醇、逆转录仪来自Takara公司；qRT-PCR仪来自Bio-Rad生物工程公司；多功能酶标仪来自TECAN公司；FLOT2抗体来自Abcam公司；过表达质粒均购自上海吉玛公司；qRT-PCR引物购自上海生工公司；倒置显微镜来自日本(OLYMPUS);二氧化碳培养箱来自American Thermo Scientific公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和转染

Huh7、HepG2、MHCC97H使用DMEM完全培养基；SNU387和Hep3B使用MEM完全培养基。使用LipofectamineTM3000进行质粒转染，将2×105个细胞接种在1 000μL含血清无双抗的完全培养基内，细胞汇合度达到80%至90%时加入质粒及转染试剂；取2.5μL LipofectamineTM3000加到100μL DMEM中；取2.5μL pcDNA-FLOT2及其对照pcDNA 3.1,加到含有5μL P3000试剂的100μL DMEM中，混匀；将LipofectamineTM3000混合物与质粒混合物慢慢混匀(此时总体积为200μL),室温孵育15 min。孵育期间，从培养箱中取出提前铺好细胞的12孔板，用1×PBS清洗2次后加800μL无血清的DMEM培养基。孵育完成后，向每孔加入转染混合物，缓慢摇晃孔板，使混合液在孔中均匀分布。将细胞培养板置于细胞培育箱中培养24至48小时后，可进行后续试验。

1.2.2 Transwell检测肝癌细胞的迁移和侵袭能力

检测细胞侵袭能力需要预先将稀释好的Matrigel基质胶加入到每个小室中，置于培养箱中使其凝固。开始实验前，向上室中加入50μL无血清培养基水化基底膜；完成水化后，将350μL细胞悬液(3×105个细胞)加入上室，在下室中加入800μL含有10% FBS的完全培养基。随后，将24孔板置于培养箱中，培养24小时。从培养箱中取出小室，吸去上室内液体，将小室放到4%的多聚甲醛中固定；0.1%结晶紫染液染色15分钟；1×PBS漂洗数次至无多余染料，用棉签轻轻擦掉上室细胞，风干小室；倒置显微镜下拍照，选取随机3个高倍镜视野计数并取平均值，统计学分析。细胞迁移实验步骤同细胞侵袭实验，但上室中不需要基质胶。

1.2.3 EdU检测肝癌细胞的增殖能力

细胞转染完成后，加入稀释好的EdU工作液，孵育3小时。去除工作液，每孔中加入1 mL 4%的多聚甲醛，室温下固定15分钟。去除固定液，每个孔用1 mL含3% BSA的PBS洗涤细胞。去除洗涤液，向每个孔中入1 mL含0.5% TritonRX-100的PBS(简称通透液)后，室温孵育20分钟。去除通透液，用1 mL含3% BSA的PBS洗涤每孔中的细胞。去除洗涤液，每孔中加入0.5 mL提前配置好的Click反应液，轻轻摇晃培养板以确保Click反应液均匀分布覆盖样品，室温避光孵育30分钟。吸去Click反应液，用1 mL含3% BSA的PBS洗涤每孔。加入1 mL 1×Hoechst 33342溶液，避光孵育30分钟后，用PBS洗涤每孔。荧光显微镜下观察染色情况，拍照计数。

1.2.4 qRT-PCR检测FLOT2表达量及细胞转染效率

实验前准备：按引物说明书加入无酶水溶解引物，混匀备用；采用试剂盒法提取RNA及逆转录。逆转录程序如下：Reaction buffer 4μL+Block RI 1μL+dNTP 2μL+RT 1μL。扩增程序如下：上、下游引物各0.8μL+5.4μL无酶水+3μL cDNA+10μL SYBR,引物序列见表1。miRNA的逆转录需要加入特异性逆转录引物，根据miRNA引物套装说明书进行实验。

1.2.5 Western Blot检测FLOT2蛋白表达水平

选择10%的分离胶和5%的浓缩胶进行蛋白电泳；电泳结束后根据目的蛋白分子量的不同设置电转时间，电转结束后将PVDF膜置于5%BSA中室温封闭3小时。置于1∶1 000稀释的一抗(兔抗人FLOT2)中，4℃摇床过夜孵育。1×TBST清洗3次，10 min/次。置于1∶10 000稀释的二抗(羊抗兔IgG)中室温孵育1小时；1×TBST清洗3次，10 min/次。按试剂说明书要求配制发光底物，发光底物覆盖PVDF膜后，使用自动曝光机曝光。

1.2.6双荧光素酶报告基因检测验证miRNA和FLOT2的结合

按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书要求操作。在96孔板中加入50μL细胞裂解液。分别将10μL萤火虫荧光素酶反应液和10μL海肾荧光素酶反应液加入孔板中，混匀。酶标仪上检测其活力，检测时间尽量控制在半小时内。

1.3统计学处理

采用GraphPad 8.0.2软件对数据进行处理和统计学分析。P<0.05表示差异具有统计学意义，用*表示；P< 0.01,用**表示；P<0.001,用***表示。

2、结果

2.1过表达FLOT2促进MHCC97H肝癌细胞的生物学功能

通过ENCORI检索发现，肝癌组织中FLOT2的表达水平比癌旁组织更高，高表达FLOT2的肝癌患者总体生存率更低(图1)。qRT-PCR检测实验室常见的五种肝癌细胞中FLOT2的mRNA表达水平，其中MHCC97H中FLOT2表达量最低(图2A)。采用质粒转染使MHCC97H细胞高表达FLOT2基因(图2B)。通过Transwell以及EdU实验比较pcDNA组和pcDNA-FLOT2组细胞的迁移、侵袭和增殖能力，结果显示pcDNA-FLOT2组细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显增强(图2C-D)。

2.2 miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因

miRNA能通过干扰靶基因编码蛋白质，进而调控肝癌细胞的生物学行为。通过TargetScan数据库检索可能调控FLOT2的miRNA,结果显示miR-148a-3p可能会靶向调控FLOT2基因(图3A)。在CancerMIRNome以及ENCORI数据库中探索肝癌组织和正常组织中miR-148a-3p的表达情况，结果显示miR-148a-3p在肝癌组织中低表达，并与FLOT2的表达量呈负相关，且与肝癌患者预后不良有关(图3B-D)。采用miR-148a-3p mimics转染MHCC97H细胞，qRT-PCR和Western Blot检测显示miR-148a-3p mimics组(简称miR-148a-3p组)细胞中FLOT2的mRNA以及蛋白水平均下降(图3E-F)。同时，双荧光素酶报告实验证实了miR-148a-3p和FLOT2的靶向调控关系(图3G)。

2.3 miR-148a-3p抑制FLOT2对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的作用

上文的结果提示miR-148a-3p靶向调控FLOT2基因，接下来通过Transwell以及EdU实验验证miR-148a-3p对肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力的影响。结果表明，miR-148a-3p组相比miR-NC组细胞的迁移、侵袭和增殖能力明显减弱(图4)。将MHCC97H细胞分为pcDNA组、pcDNA- FLOT2组和pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p组。qRT-PCR结果显示，与pcDNA-FLOT2组相比，pcDNA-FLOT2+ miR-148a-3p组FLOT2的mRNA水平明显降低(图5A)。Transwell以及EdU实验检测以上三组细胞迁移、增殖和侵袭能力。结果显示，pcDNA-FLOT2+miR-148a-3p组的迁移、侵袭和增殖能力明显减弱(图5B-C)。

3、讨论

肝癌在癌症相关死亡病因中排名第三位，在全球最常见癌症中排名第六位，肝癌发病率呈逐年上升趋势，对人体健康构成严重威胁[10]。多数HCC患者确诊时已处于晚期，丧失手术机会，且预后较差，总生存率(overall survival rate, OSR)仅为10%～18%,对于无法切除的中晚期肝癌患者可供选择的治疗方式非常有限[11,12]。因此，寻找作为肝癌早期诊断并且能够监测肝癌预后的生物标志物，是现如今研究的重点。

脂筏特征蛋白2(Flotillin2,FLOT2)是一种高度保守、普遍表达的蛋白，它位于细胞膜内侧，存在于胞质中富含胆固醇的特定微域内[5]。它参与调控多种癌症的发生发展过程。有报道表明，FLOT2的过表达与大肠癌、肺腺癌和胃癌的恶性进展有关[9,13,14]。参与多种癌症的发生发展过程，FLOT2通过调节细胞周期和诱导EMT促进HCC的肿瘤生长和转移[5]。FLOT2可以通过与EPHA2相互作用促进胶质瘤的生长和转移，不仅如此FLOT2还通过调节细胞周期和诱导上皮间充质转化促进HCC进展。实际上，FLOT2的下游机制已经得到了广泛研究和报道，然而调控FLOT2表达的上游机制鲜有相关报道。因此，寻找调控FLOT2基因影响肝癌进展的潜在上游机制具有重要意义。

微核糖核酸(miRNAs)是一种小的非编码RNA,大约有22个核苷酸，miRNA作为基因表达的调节器通过靶向调节下游基因的表达发挥作用[15]。越来越多的证据表明，异常的miRNAs在调节癌症的发生中起着关键作用[16]。miRNA通过与靶信使RNA(mRNA)的3'非翻译区(UTR)部分互补结合，在转录或转录后调节蛋白质的表达，能作为肺癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、骨肉瘤、结直肠癌等多种癌症治疗的潜在靶标[17,18,19]。也有研究表明，miRNA可作为原发性肝癌，尤其是有乙肝病毒感染史患者原发性肝癌的诊断标志物[20]。而miR-148a-3p参与调节细胞生长和凋亡，在多种癌症中(如胰腺癌、乳腺癌和肺癌)被确定为重要调节因子[21]。然而，miR-148a-3p-FLOT2轴是否参与了肝癌进展的调节仍需要进一步研究。

为了探究这一潜在机制，本研究采用质粒成功在MHCC97H细胞中过表达了FLOT2,与对照组相比FLOT2过表达组肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显提高。使用在线数据库筛选出可能调控FLOT2并且在肝癌中有预后意义的miR-148a-3p。通过miRNA模拟物过表达miR-148a- 3p,显示miR-148a-3p能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。通过双荧光素酶实验结合挽救实验证实FLOT2受miR-148a-3p靶向调控影响肝癌细胞的迁移、侵袭和增殖能力。

综上所述，FLOT2可能是通过miR-148a-3p的调控影响肝癌细胞迁移、侵袭和增殖能力，这为肝癌的治疗提供可能靶点。但本文只通过细胞水平验证了miR-148a-3p靶向FLOT2影响肝癌的恶性行为，未来可以在动物模型中进一步探究，从而为提高肝癌患者预后提供更可靠的理论依据。

参考文献:

[3]李一凡,杜冀晖,赵慧,等.FLOT2在结直肠癌中的表达及其临床意义[J].医学研究杂志,2021,50(3).6.

[6]雷董,张涛,叶斌,等.RNA干扰FLOT2基因表达下调NF-xB信号对胃癌细胞凋亡诱导作用研究J]胃肠病学和肝病学杂志,2019.28(6)620-624.

[8]万晓庆,王学健,王艺斐,等.循环microRNAs的外泌形成机制及其对乳腺癌侵袭和转移的影响[J]生物化学与生物物理进展,2017,44(4)289-278.

[11]吴虹霖,牛翔科,熊燕,等.肝细胞肝癌的免疫治疗现状及研究进展[J].中国免疫学杂志,2021,37(22);2771-2778.

基金资助:中国医学科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(编号:2020-PT330-003);国家自然地区科学基金项目(编号:82060297);兵团指导性科技计划项目(编号:2022ZD041);兵团财政科技计划项目区域创新引导计划(编号:2021BB006);石河子大学自主支持科研项目(编号:ZZZC202026A);

文章来源:王芊文,李文华,逯君霞等.miR-148a-3p靶向调控FLOT2促进肝癌细胞迁移､侵袭及增殖[J].现代肿瘤医学,2023,31(21):3921-3927.