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鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌细胞生物学行为的影响

2023-10-10 60 上传者：管理员

摘要：目的:运用生物信息学方法筛选出鼻咽癌相关核心基因苏氨酸和酪氨酸激酶(threonine and tyrosine kinase, TTK),探讨其在鼻咽癌组织中的表达；敲低TTK对人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响及可能存在的机制。方法:利用生物信息学方法，基于GEO数据库中鼻咽癌患者数据集，筛选出与鼻咽癌发生发展相关核心基因TTK;免疫组化实验检测TTK在鼻咽癌组织和慢性鼻咽炎组织中的表达；慢病毒转染人鼻咽癌CNE2细胞敲低TTK后，CCK-8实验检测敲低TTK对CNE2细胞增殖的影响；流式细胞实验检测TTK低表达后对CNE2细胞凋亡及周期的影响；Western Blot实验检测CNE2细胞在TTK低表达时，凋亡信号通路中关键蛋白BCL-2、BAX蛋白表达情况，探究TTK在鼻咽癌发生发展中可能存在的机制。结果:生物信息学方法筛选出核心基因TTK。TTK在鼻咽癌组织中呈现高表达，在慢性鼻咽炎组织中呈现低表达。敲低TTK后，CNE2细胞增殖受到抑制，细胞凋亡增加。细胞周期G1期减少且S期和G2期增加，提示敲低TTK导致细胞阻滞于S/G更多

关键词：
TTK
凋亡
凋亡通路
增殖
生物信息学
细胞周期
鼻咽癌
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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是临床常见的头颈恶性肿瘤之一，具有地域分布性，常好发于我国南部地区[1]。鼻咽癌患者经过常规治疗后虽然5年生存率明显提高，但是远处转移及复发仍是影响鼻咽癌患者总体生存的重要因素之一[2]。因此，寻找新的鼻咽癌分子标志及治疗靶点是当前临床治疗迫切需要的。苏氨酸和酪氨酸激酶(threonine and tyrosine kinase, TTK)可以磷酸化丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸[3]。纺锤体组装检查点(SAC)核心组成部分为TTK,SAC是有丝分裂的关键监控机制，可以通过延迟有丝分裂的过程来防止染色体的错误分配。SAC的异常最终会导致染色体不稳定和非整倍体形成甚至细胞死亡，正常功能的SAC可以保证细胞的生长和分裂[4,5,6]。研究发现除睾丸和胎盘外，TTK基因的转录在正常器官中几乎不表达。然而，在许多人类恶性肿瘤中可以检测到TTK的高表达[7]。TTK在正常组织和恶性肿瘤组织之间差异表达，提示其作为诊断的分子生物标志物的潜力。本研究通过生物信息学方法筛选出鼻咽癌相关核心基因TTK,免疫组化检测TTK在鼻咽癌组织中的表达；敲低TTK后观察对鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响并探究凋亡机制，旨在为TTK成为鼻咽癌新的分子标志及治疗靶点提供理论依据。

1、材料与方法

1.1生物信息学筛选核心基因及验证

1.1.1数据集的获取与筛选差异表达基因(DEGs)

在GEO数据库(https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中搜索NPC相关基因芯片，纳入标准：(1)种属：人类；(2)含有NPC组织和非癌性鼻咽组织。排除标准：经放化疗处理后的NPC组织。最后检索得到基因芯片：GSE53819和GSE12452。通过GEO数据库中GEO2R在线分析工具对GSE53819和GSE12452基因芯片进行数据分析，筛选条件为：P<0.05且∣logFC∣≥1,将logFC≥1定义为上调，logFC<1定义为下调，分别得到2个基因芯片的差异表达基因。将数据导入到韦恩(http: //bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)在线分析工具并取交集得到共同的DEGs。

1.1.2 PPI网络构建

通过STRING数据库将DEGs进行蛋白质-蛋白质互作网络分析(PPI),并通过Cytoscape(v3.9.1)软件构建核心基因模块。

1.1.3基因表达验证及预后分析

通过GEPIA(http: //gepia.cancer-pku.cn/)对核心基因进行表达水平差异验证，Kaplan-Meier Plotter(K-M plotter, http: //kmplot.com/analysis/)进行预后分析。

1.2免疫组化实验

1.2.1标本资料

收集2016年01月至2019年12月期间我院病理科初诊鼻咽癌患者96例，慢性鼻咽炎患者30例。所有患者均具有完整的病理组织石蜡标本，鼻咽癌患者尚未接受任何相关的治疗；鼻咽癌患者全部入院接受常规标准治疗，病历资料保存完整。

1.2.2免疫组化实验及结果判定

将石蜡标本切片、制片，免疫组织化学Super Vision二步法检测切片中TTK的表达情况。两位病理科医生在双盲原则下对染色结果进行判定。阳性等级由染色程度与阳性细胞数比率的乘积决定，染色强度按照无着色、淡黄色、棕黄色和棕褐色分别计为0分、1分、2分、3分；阳性细胞数比率按照0%～5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%分别计0分、1分、2分、3分、4分。

1.3细胞实验

1.3.1细胞转染及转染效果验证

慢病毒LV-TTK-shRNA(LV-TTK-shRNA1/2/3)及阴性对照LV-NC-shRNA由上海吉玛制药技术有限公司设计与合成。按照吉玛公司慢病毒转染操作说明书进行实验。将转染后的CNE2细胞分别提取总RNA和总蛋白，通过qRT-PCR实验和Western实验分别验证转染效果同时筛选出最有效的敲低序列。使用最有效的敲低序列进行后续实验，将CNE2细胞分别转染LV-TTK-shRNA(TTK敲低组)和阴性对照序列LV-NC-shRNA(NC组),以未转染的CNE2细胞作为空白对照组(Control组)。

1.3.2 CCK-8实验

将三组细胞分别制成5×103 /孔的细胞悬液并加入至96孔板中培养；分别培养至24 h、48 h、72 h后加入CCK-8试剂10μL并在37℃、5%CO2条件下避光孵育1 h;使用酶标仪测定吸光值(OD值450 nm)分析每组细胞生长状况。

1.3.3细胞凋亡实验

将三组细胞分别用不含EDTA的胰酶进行消化收集细胞后离心、计数制成约5×105个细胞的混悬液，接种于EP管中。每管加入500μL Binding Buffer、5μL Annexin V-APC、5μL 7-AAD混悬细胞染色，室温、避光孵育10 min后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3.4细胞周期实验

将三组细胞分别用胰酶消化并收集约5×105细胞于EP管中，加入0.3 mL PBS和1.2 mL -20℃无水乙醇重悬细胞，涡旋剧烈震荡后置于-20℃冰箱过夜。离心弃上清，加入1 mL PBS重悬细胞，室温放置15 min。再次离心弃上清，加入100μL RNase A充分悬浮细胞，37℃水浴30 min。加入400μL的PI溶液充分混匀，2～8℃避光孵育30 min。孵育结束后立即使用流式细胞仪测定细胞周期。

1.3.5 Western Blot实验测定BCL-2、BAX蛋白的表达

将敲低组和空白对照组细胞分别加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)并置于冰上裂解30 min。充分裂解后收集并离心，取上清液作为细胞总蛋白。BCA法测定蛋白浓度，制版，上样，电泳，转膜，快速封闭液封闭30 min,一抗BCL-2(1∶1 000)、BAX(1∶1 000)于4℃下孵育过夜，二抗孵育1 h, Bio-Rad成像仪曝光成像。

1.4统计学方法

统计软件采用SPSS 26.0进行统计分析，采用GraphPad Prism v8.0软件进行统计图表绘制。计量资料用均数±标准差(x¯±s)

表示，计量资料用t检验，计数资料用卡方检验，组间比较用方差检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1生物信息学筛选核心基因及验证

2.1.1获取共同DEGs

通过GEO数据库分别得到2个基因芯片的差异表达基因。经韦恩图在线分析得到587个共同DEGs,其中384个基因表达上调，203个基因表达下调(图1)。

2.1.2构建PPI网络及核心基因模块

将共同的DEGs数据导入到STRING数据库中，得到PPI网络图，然后将数据导入到Cytoscape软件中，利用MCC算法得到连接度排名前20的核心基因模块(图2)。

2.1.3差异表达及预后分析

选取TTK作为后续研究对象。GEPIA数据库结果提示TTK在头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSC)组织中高表达(图3A);K-M Plotter数据库结果提示在HNSC患者中TTK高表达组的预后低于低表达组(图3B)。差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 TTK在NPC组织中的表达

TTK在NPC组织中主要定位于细胞质，高表达细胞质呈现棕色或深棕色颗粒，细胞排列紊乱、异形、大小不一。而TTK在慢性鼻咽炎组织中呈低表达，细胞排列规则有序，细胞质无着色或着浅黄色，见图4。96例鼻咽癌组织中TTK高表达77例、低表达19例，30例慢性鼻咽炎组织中TTK高表达6例、低表达24例。TTK在鼻咽癌组织中的高表达率为80.2%(77/96),显著高于慢性鼻咽炎组织的20.0%(6/30),差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.3细胞实验结果

2.3.1慢病毒转染CNE2细胞后效果验证

通过qRT-PCR和Western Blot实验分别检测慢病毒转染CNE2细胞72小时后CNE2细胞中TTK的mRNA及蛋白表达情况。实验结果显示与Control组(空白对照组)对比TTK-shRNA-1组TTK mRNA和蛋白表达量明显降低，见图5,差异均具有统计学意义。因此，TTK-shRNA-1组敲低效率最高，选用Control组(空白对照组)、NC组(阴性对照组)、TTK-shRNA-1组(后续实验标为TTK-shRNA组)进行后续实验。

2.3.2敲低TTK对CNE2细胞增殖的影响

通过CCK-8实验检测敲低TTK对CNE2细胞的影响，分别测得铺板后0 h、24 h、48 h、72 h的OD值，结果显示敲低TTK后抑制CNE2细胞的增殖，见图6,差异具有统计学意义。

2.3.3敲低TTK对CNE2细胞凋亡和周期的影响

流式细胞实验检测TTK敲低后对CNE2细胞凋亡和周期的影响，结果显示敲低TTK促进CNE2细胞的凋亡，见图7,差异具有统计学意义(P<0.05)。TTK敲低后CNE2细胞G1期缩短，S期、G2期延迟，表明TTK敲低引起CNE2细胞阻滞在S/G2期，见图8,差异具有统计学意义(P<0.000 1)。

2.3.4敲低TTK对BCL-2、BAX蛋白表达的影响

TTK敲低后抗凋亡蛋白BCL-2的相对表达量降低，凋亡蛋白BAX相对表达量升高。结果提示TTK敲低引起CNE2细胞的凋亡可能与激活凋亡信号通路有关，见图9,差异具有统计学意义(P<0.000 1)。

3、讨论

TTK不仅参与对有丝分裂的调控，TTK还在中心体复制、DNA损伤反应和器官发育等其他过程中发挥作用[8]。因此，不正常的表达TTK必然影响正常的生理功能，可能会导致严重的染色体错配，最终导致染色体不稳定、非整倍体形成，甚至癌细胞的形成。Northern印迹分析表明，除睾丸和胎盘外，TTK基因在正常器官中的表达水平很低。然而，TTK在许多类型的人类恶性肿瘤中水平很高，包括膀胱癌[9]、非小细胞肺癌[10]和乳腺癌[11]等。这些实验结果表明，TTK是一个典型的原癌基因。然而，除了对细胞有丝分裂的明确研究外，TTK蛋白在肿瘤发生的具体机制，特别是在鼻咽癌发生发展中的作用尚未广泛的研究。

本研究中利用生物信息学方法对鼻咽癌患者基因芯片进行分析，最终筛选出鼻咽癌相关核心基因TTK,并通过GEPIA和Kaplan-Meier Plotter验证了TTK在HNSC中呈高表达并影响患者预后。这些结果预测了TTK对鼻咽癌可能会有类似作用。免疫组化实验结果表明TTK在鼻咽癌组织中高表达且影响预后，实验结果与生信分析结果相符合，表明TTK可作为鼻咽癌诊断及评估其患者预后的潜在指标。利用慢病毒转染敲低TTK后鼻咽癌CNE2细胞的增殖被抑制、凋亡增加、周期阻滞；有研究表明TTK基因的敲除抑制了肾透明细胞癌和前列腺癌细胞的增殖以及促进了肿瘤细胞的凋亡[12,13]。这些与本研究结果相符合，进一步证实了TTK基因是一个与鼻咽癌恶性相关的基因，有可能成为临床应用的新靶点。

在敲低TTK后凋亡通路关键蛋白BCL-2表达降低和BAX蛋白表达升高，这些关键蛋白的变化表明TTK可能通过凋亡通路影响鼻咽癌CNE2细胞的生长。在今后研究中可继续验证鼻咽癌中TTK与其他凋亡通路关键蛋白的关系，进一步证明TTK通过凋亡通路影响鼻咽癌。此外，有研究表明TTK可通过Akt-mTOR通路对胃癌和肝细胞肝癌进行调控[14,15],那么TTK是否也通过Akt-mTOR通路对鼻咽癌进行调控，值得进一步研究。

鼻咽癌治疗原则为“放疗为主、化疗为辅、特殊情况下选择手术”,对于局部晚期或复发鼻咽癌患者，可联合应用分子靶向及免疫治疗等新型生物治疗手段[16,17,18]。TTK通过增加辐射诱导的DNA损伤、凋亡和坏死来调节肝细胞肝癌的放射敏感性[19];TTK在顺铂耐药的卵巢癌细胞系中表达上调，下调TTK可以恢复卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[20]。以上研究表明了TTK与肿瘤放疗敏感性和顺铂耐药性具有相关性，对于以放化疗为主要治疗手段的鼻咽癌值得进一步探讨TTK是否也具备相关性。同时，TTK抑制剂也在开发中，有些已经进入临床试验[21]。这些研究表明TTK对于肿瘤诊断与治疗的巨大潜在作用。

综上，本研究从生物信息学、组织形态学、细胞生物学三个层面揭示了TTK成为鼻咽癌新的分子标志及治疗靶点的潜力，为TTK对于鼻咽癌的作用提供了理论基础。

参考文献:

[1]张力.鼻咽癌的综合治疗进展[J].肿瘤防治研究,2019,46(8):667-671.2.

[16]康敏.中国鼻咽癌放射治疗指南(2022版)[J].中华肿瘤防治杂志,2022,29(9):611-622.

[18]杨保庆.局部晚期鼻咽癌治疗现状及进展[J.现代肿瘤医学,2021,29(02):337-341.

基金资助:川北医学院附属医院课题基金(编号:2022JC016);

文章来源:吴蕴生,李萍,冯燚源等.TTK在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌细胞生物学行为的影响[J].现代肿瘤医学,2023,31(21):3945-3950.