原发性肝癌是2020年全球发病率和死亡率排名前列的癌种，其中肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 占原发性肝癌的75%～85%[1]。药物治疗是晚期HCC治疗的主要手段，而耐药是癌症治疗失败的主要原因。无论是传统的化学药物还是分子靶向药物，都会面临因耐药带来的挑战[2]。导致耐药的因素诸多，2008年MANI教授团队[3]首次描述了上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和耐药性之间的关系并提出阻断或逆转EMT可能导致化学耐药细胞恢复到化学敏感细胞。近年来，EMT因其在癌症耐药过程中的作用而受到越来越多的关注。本文将重点关注目前肝癌耐药中发生EMT过程的各种相关因子，以及针对EMT预防耐药性的潜在治疗策略。

EMT是复杂的分子和细胞重编程过程，从而导致细胞的运动性、侵袭性、逃避免疫细胞的能力以及抗细胞凋亡的能力增强[4]。EMT具有如下特征：①EMT是胚胎发育中形态发生事件的重要过程，它使不动的上皮细胞能够获得运动的间充质表型。上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达减低，间充质标志物波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)表达升高。在癌症中，这种发育过程的不当诱导可能是灾难性的，因为它们赋予分化的无蒂上皮细胞迁移和侵袭性特征，从而启动肿瘤转移级联反应的第一步。②间充质细胞可以经历反向表型转换，通过间充质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)重新获得上皮表型，从而定植新位点并在远处器官中产生继发性肿瘤[5,6]。因此，EMT是一个动态且可逆的过程，它使癌细胞在转移过程中在上皮和间充质状态之间可逆地转变。为了更好地描述转移可塑性这一过程，有些学者提出了混合上皮-间充质状态这一新概念。

事实证明，EMT过程在肿瘤细胞对吉西他滨、奥沙利铂和紫杉醇等常规化疗药物的多药耐药性中非常重要。例如，使用不同胰腺癌细胞系的独立实验证实，对吉西他滨、5-氟尿嘧啶和顺铂的耐药性与E-cadherin和EMT转录因子Zeb1表达之间密切相关[7]。此外，在阿霉素耐药的MDA-MB-468、HCC1937、 MCF-7细胞中，GUAN等 人[8]发现Vimentin表达显著增加，E-cadherin表达减少。对顺铂耐药的卵巢癌细胞表现出EMT表型改变[9]。这些数据表明EMT在化疗后癌症转移和耐药性中起主要作用。除了化疗耐药性外，EMT过程已被证明对分子靶向药物耐药性有显著影响。例如，肺癌细胞中对表皮生长因子受体抑制剂的敏感性涉及上皮性而非间充质的基因表达谱[10]。这些发现也用于其他类型的癌症，如结直肠癌和HCC。同样，对他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞表现出EMT的形态变化，EMT转录因子Slug表达增加[11]。同时，与曲妥珠单抗孵育的食管腺癌细胞降低了上皮标志物(CD24、CD29和CDH1)的表达，并促进了间充质标志物(Vimentin、ZEB1、SNAI2和CXCR4)的表达[12]。

1、EMT在HCC耐药机制中的研究进展

HCC对化疗药物的敏感性较低，这在很大程度上是由多药耐药(multi-drug resistance, MDR)引起的。促进药物外排的膜转运蛋白活性升高、缺氧的肿瘤微环境和DNA损伤修复机制异常是导致MDR的已知机制。目前研究表明，各种细胞因子、转录因子、非编码RNA和信号通路诱导EMT发生过程也与肝癌耐药密切相关。具有间充质特性的肿瘤细胞通常表现出原发性耐药性。例如，肝癌细胞发生EMT后对奥沙利铂的敏感性降低，耐药细胞表现出间充质细胞形态[13]。此外细胞的表型转换通过促进肿瘤的MDR和复发来影响癌症患者预后。EMT过程提供了一种连接克隆进化和肿瘤干细胞(cancer stem cell, CSC)模型的桥梁，并形成了表型可塑性模型的基础[14]。

1.1 肿瘤干细胞促进EMT参与HCC耐药

EMT已成为表现出干细胞样特性癌细胞的重要生物学过程，CSC是已知对治疗具有抗性并引起转移的癌细胞亚群。虽然关于CSC是否是原发性肿瘤起源的争论仍在继续，但CSC在许多癌症中得到了进一步的研究，数据表明CSC通过增强的EMT特性，增强的ATP结合盒(ATP-binding cassette, ABC)膜转运蛋白的表达，激活几种信号通路和增加的免疫逃避以及DNA修复机制表现出强大的自我更新能力、耐药能力[15]。癌细胞获得干细胞的特性，即从非CSC到CSC的过渡，通过EMT的过程获得侵袭性间充质表型而发生。非CSC通过进行EMT获得间充质表型，产生具有促进肿瘤进展、复发、转移和对治疗抵抗特征的CSC。近期证据表明，同时表现CSC和EMT表型的HCC患者对标准化疗无反应，且无进展生存期短[16],这可以通过CSC的持久性来解释，部分CSC由EMT生成和维护。此外，越来越多的证据表明，HCC中的索拉非尼耐药性与EMT的激活和CSC性状的富集相关[17],与ABC转运蛋白的上调、角蛋白19的高表达和转化生长因子-β/果蝇抗成形素蛋白(transforming growth factor-β/drosophila mothers against decapentaplegic protein, TGF-β/SMAD)通路的过度激活有关。后者对于EMT和肝癌干细胞(liver cancer stem cell, LCSC)的形成至关重要。TGF-β导致β-连环蛋白的核积累，进而导致上皮标志物的丢失和干细胞标志物的过度表达[18]。TGF-β通路增加了HCC细胞中酪氨酸激酶受体的表达，从而抵消了索拉非尼诱导细胞凋亡的能力[19]。

1.2 EMT相关转录因子参与HCC耐药

EMT受TWIST、ZEB1/2和Snail等多种转录因子(transcription factors, TFs)的调节，这些TFs抑制上皮标志物E-cadherin的表达、促进间充质标志物(N-cadherin、Vimentin)的激活[20]。现有研究发现这些TFs参与了EMT介导的HCC对化疗药物和分子靶向药物耐药过程。

ZHANG等[21]通过敲低TWIST,抑制Hep3B、Huh7、SNU387 和 SNU449肝癌细胞的EMT,增加了这些肝癌细胞对阿霉素的敏感性。另外HU等[22]通过索拉非尼敏感和耐药患者衍生异种移植物模型之间的表达谱比较，确定了核转运蛋白亚基alpha3(karyopherin subunit alpha 3,KPNA3)是HCC中索拉非尼耐药的关键介质，为了明确KPNA3是否通过EMT来增强耐药性，发现TWIST在KPNA3-OE HCC细胞中的表达显著增加，TWIST是 HCC 中KPNA3的潜在下游靶点。为了进一步证实，使用siRNA敲低TWIST表达，与对照组肝细胞相比，TWIST-KD HCC细胞中N-cadherin的表达下调、E-cadherin的表达上调，而当KPNA3-KD细胞中TWIST重新过表达则恢复了它们对索拉非尼的耐药性。综上所述，这些数据不仅支持EMT与肝癌耐药之间的相关性，而且表明TWIST是关键下游靶点，在EMT介导的耐药性中起重要作用。

另一个重要的转录因子ZEB2通过调节EMT在肿瘤侵袭、转移和耐药性中发挥关键的作用[23]。耐紫杉醇肝癌细胞系Huh7/PTX中的ZEB2蛋白表达水平升高，表明ZEB2高表达导致HCC细胞对紫杉醇耐药，用ZEB2过表达载体转染Huh7/PTX 细胞，发现E-cadherin、细胞角蛋白18降低，N-cadherin、Vimentin表达升高，同时紫杉醇对Huh7/PTX细胞的半数抑制浓度远远增加，对紫杉醇的敏感度下降。沉默ZEB2基因得到相反的结果。由此证实ZEB2诱导的EMT途径和肝癌细胞对紫杉醇的耐药性密切相关[24]。

Snai1/Snai2以往被称作Snail/Slug, 是锌指家族转录因子成员，其最知名的一个功能是诱导EMT。WANG等[25]发现HCC样本中顺反异构酶(peptidylprolyl cis/trans isomerase, Pin1)高表达的样本，转录因子Snail也高表达，Pin1和Snail在SMMC-7721/Rego瑞戈非尼耐药株中皆呈现过表达，与亲本细胞相比，瑞戈非尼耐药细胞表现出EMT特征形态。敲低 Pin1基因同时下调 Snail表达，瑞戈非尼耐药HCC细胞的迁移、侵袭能力也降低，进而改善了HCC细胞对瑞戈非尼的耐药性。研究结果表明，Pin1可能通过调节Snail影响了EMT进程进而调节肝癌细胞对瑞戈非尼的耐药性。

转录因子Slug已被确定为胚胎发育、器官纤维化和癌症进展期间EMT的关键调节因子，因为它是E-cadherin表达的有效抑制因子。然而，Slug还可以通过抑制增殖、驱动细胞分化和抑制肿瘤起始来充当肿瘤抑制因子[26]。故Slug蛋白在肿瘤发生和转移中的作用仍存在很大争议。ZHAO等人[27]利用shRNA慢病毒转染肝癌细胞以及细胞成瘤实验分析了Slug缺失对肝癌细胞锚定非依赖生长的影响，随后检测肝癌细胞Slug分子缺失对喜树碱、阿霉素和表柔比星化疗药物敏感性的影响。结果表明，当shRNA抑制Slug表达时，肝癌细胞锚定非依赖性生长能力以及集落形成能力均显著增加。抑制Slug蛋白表达增强了肝癌细胞对以上化疗药物的耐药性。机制研究通过荧光素酶测定证实了Slug对ATP结合盒转运体B1(ATP-binding cassette subfamily B member 1,ABCB1)等ABC转运蛋白基因的转录抑制。总之Slug分子抑制HCC的EMT发生和抑制MDR。

1.3 EMT相关细胞因子参与HCC耐药

在诸多细胞因子中能够诱导EMT发生的细胞因子并不多，已知的有TGF-β、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)、白介素-6(interleukin 6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors, TNF-α)。这些细胞因子作为EMT的诱导剂通过诱导HCC细胞发生EMT使HCC对化疗药物和分子靶向药物的敏感性减低。

TGF-β是最有效的EMT诱导剂。TGF-β激活索拉非尼介导的细胞凋亡抗性基因的转录，最终促进EMT发生从而引起索拉非尼的耐药性[28]。SHRESTHA等[29]研究表明，TGF-β过表达能增强肝 癌细胞迁移和侵袭能力， 使用TGF-β受体激酶抑制剂SB431542能增加索拉非尼对细胞的毒性作用。骨形态发生 蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)是TGF-β超家族的成员之一，BMP4在EMT中起着关键作用，EMT对于肿瘤获得化学耐药性至关重要[30]。MA等人[13]首先研究了BMP4与EMT标志物在人HCC组织中蛋白质水平上表达的相关性，免疫组化结果显示，BMP4的蛋白质表达与E-cadherin之间存在显著的负相关，但BMP4和Vimentin蛋白表达之间存在统计学上的正相关。机制研究应用RT2 Profiler PCR阵列分析了BMP4处理和BMP4受体拮抗剂处理的HepG2细胞之间的84个化学抗性基因，结果显示，E26转录因子1(E-twenty six transcription factor 1,ELK1)分子变化最显著，在mRNA表达水平上变化7.45倍。使用丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1,MEK1)抑制剂抑制HepG2细胞中BMP4诱导的ELK1磷酸化，可同时抑制EMT。MEK1抑制剂和ELK-1 siRNA都增加 了BMP4处理的HepG2细胞对奥沙利铂的敏感性。这些结果表明，由BMP4诱导的EMT促进的奥沙利铂耐药性是通过HCC中的MEK1/胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)/ELK 1信号介导的。

HGF是促进EMT的另一个重要的细胞因子。CHEN等[31]发现在HGF刺激下，下游信号传导蛋白ERK和信号传导和转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT3)在HCC细胞中被激活，抑制ERK和STAT3逆转了HGF诱导的索拉非尼耐药性。通过检测Snail的表达，确定了HGF通过激活p-ERK/Snail/EMT和p-STAT3/Snail/EMT途径诱导索拉非尼耐药性。瑞戈非尼对p-ERK和p-STAT3的抑制作用可以阻断HGF诱导的EMT,从而逆转HGF诱导的索拉非尼耐药。

IL-6是一种存在于肿瘤微环境中的细胞因子，是EMT常见的激动剂之一。LI等[32]建立了稳定的索拉非尼耐药HCC细胞系PLC/PRF/5-R,发现同时具有EMT特征及表达干细胞标志物的HCC细胞IL-6、多药耐药基因的表达显著增加。通过慢病毒介导的细胞转染构建稳定的阻断IL-6的LCSC细胞系，并建立裸鼠皮下移植瘤模型，结果发现，索拉非尼联合shRNA IL-6组的肿瘤体积小于单药索拉非尼组，索拉非尼联合抑制IL-6表达增强了异种移植肿瘤的抗肿瘤作用，恢复了耐药肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。

TNF-α为诱导肿瘤坏死的抗肿瘤细胞因子，可以通过激活核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通路，诱导Snail表达，从而介导EMT[33]。TAN[34]分析了62例接受手术切除并随后接受索拉非尼辅助治疗的HCC患者中 TNF-α表达与预后的相关性，发现高TNF-α表达与术后接受索拉非尼辅助治疗的HCC患者的不良预后相关。随后又在不同的HCC细胞系中确定了TNF-α表达与索拉非尼敏感性的关系，体外实验结果表明，TNF-α通过诱导EMT促进HCC细胞对索拉非尼产生耐药性。抑制TNF-α的表达，在体内外均显著增强了索拉非尼对高表达TNF-α的HCC细胞的抗肿瘤作用。

肿瘤微环境中除了肿瘤细胞，还存在各种细胞因子通过诱导不同的转录因子从而使肝癌细胞发生EMT导致耐药或是增强肿瘤耐药性。

1.4 EMT相关信号通路参与HCC耐药

EMT需要高度调控和协调以确保基因在空间和时间上正确激活，不同的信号通路参与此过程的调控。据报道许多EMT相关的信号通路参与HCC细胞的耐药性，已知有经典的磷脂酰肌醇-3激酶-丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase, PI3K/AKT)信号通路，还有关于Hedgehog(Hh)信号的研究报道。

PI3K/AKT信号通路是调控肿瘤细胞EMT的信号通路之一。DONG等人[35]进一步研究发现由于Snail的过表达而经历EMT的耐索拉非尼HCC细胞，通过增加ABC转运蛋白P-gp的表达而产生对索拉非尼的抗性。PI3K/AKT/Snail信号传导是索拉非尼耐药HCC细胞中EMT和MDR过程的关键调节因子，这种机制可以作为潜在的治疗靶点。

尽管有大量证据表明Hh信号 传导与EMT调节和致癌作用有关，但直到近年来才阐明其在EMT介导的化学抗性中的作用。间充质细胞可以通过转运蛋白的上调获得化学抗性，并且已知EMT和转运蛋白都受Hh信号传导的调节。在Huh-7和HLE DN肝癌亚群中，较高的Hh通路活性与增强的侵袭能力、EMT获得和增 加的ABC转运蛋白表达相关，从而导致化学抗性的增强[36,37]。间充质细胞利用EMT相关因子 来上调各种耐药机制，如转运蛋白进一步增强化疗耐药性。

1.5 非编码RNA促进EMT参与HCC耐药

除转录因子外，EMT相关基因表达还受非编码RNA调控，微小RNA(microRNA,miRNA)是小的非编码RNA,在HCC中miRNA的研究取得了很大进展。大量研究一致证明，HCC的发生和进展与miRNA的差异表达密切相关，相当数量的miRNA直接参与癌细胞的耐药性[38]。

外泌体miR-32-5p被证实激活PI3K/AKT通路，并通过调节HCC中的血管生成和EMT来诱导MDR[39]。miR-122可以抑制EMT和ABC转运蛋白、抗凋亡基因和细胞周期相关基因的表达，从而抑制肿瘤细胞转移能力和恢复HCC对阿霉素的敏感性[40]。耐阿霉素肝癌细胞系HepG2/ADM和Huh7/ADM中的miR-145表达显著降低，并且具有EMT特征[41]。从而我们得知miR-145调节EMT导致肝癌对阿霉素敏感性减低，上调 miR-145可能是治疗化疗耐药HCC的潜在治疗策略。另外，miR-212-3p通过靶向ZEB2抑制HCC中的EMT过程并增加细胞对紫杉醇的敏感性[42]。

lncRNA是长度大于200个核苷酸的长链非编码RNA,作为一种调控因子，在肿瘤组织EMT过程中发挥着重要作用，近年来lncRNA在化疗耐药中的作用和功能也得到了广泛的研究。ZHANG等[43]发现 HCC细胞系中linc-ROR 表达最低的Huh7细胞系对阿霉素最敏感。相比之下，SNU449细胞系是HCC细胞系中linc-ROR表达水平最高的，并且对阿霉素的抵抗力最强，结果表明，有高linc-ROR表达水平的 HCC细胞对阿霉素的抵抗力更强，随后发现敲低linc-ROR抑制TWIST1的表达来显著抑制EMT,从而恢复了肝癌细胞对阿霉素的耐药性。此外一些lncRNA,如HOTAIR,也通过下调E-cadherin来促进对索拉非尼的耐药性[44]。

EMT在HCC中的耐药机制如图1,HCC细胞耐药机制总结于表1。

图1 EMT在HCC中的耐药机制   

表1 HCC细胞耐药机制

2、新的治疗策略：靶向EMT

基于EMT对肝癌耐药性的作用，一些相关研究应运而生。EMT是一个可逆的过程，其中包含可靶向的元件，例如信号连接点或调节性 miRNA,其中一些靶向EMT的药物已经被投入到肝癌相关的临床研究中。

大量实验数据显示，EMT-TFs在肿瘤进展和化学耐药性中的作用，为靶向EMT-TFs或了解其在癌症中的调节途径提供了基本原理。由于许多研究[45,46]观察到通过递送靶向EMT-TFs的小干扰RNA来恢复化疗敏感性，因此siRNA递送和化疗的组合可能是一种新形式的联合治疗。除了靶向EMT-TFs本身之外，还可以考虑靶向促进其激活的信号。在肝癌中，激活PI3K/AKT信号通路传导对于Snail表达和索拉菲尼耐药性至关重要。AKT 抑制剂 MK-2206抑制PI3K/AKT-Snail通路，并使肝癌细胞对索拉非尼再敏感。

EMT和CSC的关联也成为确定新型靶向药物以改善HCC患者临床结局的基础。一种潜在的方法是使用单克隆抗体靶向调节具有EMT表型的CSC的表面抗原。例如，使用针对CD133的特异性单克隆抗体被证明在消除具有CSC和EMT表型的HCC细胞方 面是有效的。研究表明[47],shRNA介导的CD133敲低逆转了EMT表型，减弱了CD133阳性LCSC的自我更新、增殖和迁移能力，并抑制CSC肿瘤异种移植物的生长。另一种方法是进行高通量化学筛选，以识别EMT产生的CSC中可能诱导细胞死亡的化合物。离子载体盐霉素被确定为潜在的CSC靶向剂，随后发现可在不同恶性肿瘤中阻断肿瘤形成和体内转移。盐霉素与化疗药物如多柔比星和5-氟尿嘧啶联合使用可在HCC细胞中发挥协同细胞毒性作用。这些联合治疗能够针对CSC和EMT表型[48]。鉴于盐霉素在HCC临床前研究中的成功，可以设想它将成为未来临床研究的对象。

此外，靶向EMT的诱导剂也正在研究， 在一项关于Galunisertib(TGF-β1受体I型抑制剂)和索拉非尼在晚期HCC患者的Ⅱ期临床实验中[49],44例肝功能为Child-Pugh A级的晚期HCC患者接受口服Galunisertib(150 mg)联合索拉非尼(400 mg)bid, 结果发现Galunisertib联合索拉非尼队列中位进展时间(time to progression, TTP)为4.1个月，中位总生存期(overall survival, OS)为18.8 个月。其中2例患者部分缓解，21例疾病稳定，13例疾病进展。亚组分析表明，基线 AFP≥400 ng/mL的患者或基线TGF-β1≥基线中位数的患者表现出TTP更长的趋势；TGF-β1应答者(较基线下降>20%)与无应答者相比，OS延长10.8个月(22.8个月vs 12.0个月，P=0.038),Galunisertib和索拉非尼的组合可以延长患者的OS。该结果为未来研究如何将Galunisertib与HCC的其他标准治疗最佳结合起来奠定了基础。

如上所述，miRNA在调节EMT和治疗抵抗中发挥着重要作用，这允许我们假设靶向miRNA适用于EMT引起的HCC细胞的耐药。ZENG等[50]通过miR-122-InP@ZnS量子点纳米复合材料的多功能石墨烯-P-gp递送miR-122选择性靶向HCC异种移植肿瘤，诱导HCC细胞发生凋亡减轻了阿霉素耐药性。miRNA相关的转录调控过程也达到了临床利用水平，如合成miRNA模拟物。据报道，在一个基于miR-34a模拟物的靶向miRNA药物MRX34,每周两次在晚期实体瘤患者中给药的I期临床试验中[51](NCT01829971),可用的第一阶段的研究目的是评估MRX34在晚期实体瘤患者中的最大耐受剂量、安全性、药代动力学和临床活性。其中1例HCC患 者获得了长期的部 分缓解状态，持续48周，4例患者疾病稳定。这是靶向 miRNA抑制EMT概念可用性的第一个临床证据。

3、结论和展望

EMT本身并不直接导致药物耐药，但发生EMT过程参与的各种因子与上调的耐药机制有关。例如，EMT转录因子的上调已被证明可以调节几种ABC转运蛋白的表达以促进化学耐药性。更准确地说，EMT相关分子的上调促进了各种耐药机制，包括增殖速率慢，抗凋亡蛋白表达升高以及介导药物流出的ABC转运蛋白的上调[52],这些机制不可避免地导致转移、侵袭和化学耐药性增强。总之，EMT是驱动耐药性的重要癌细胞表型。这种细胞过程的抑制剂将作为化疗或靶向治疗药物的良好“合作伙伴”,从而显著改善当前癌症治疗的临床结果。虽然目前针对EMT的治疗策略仍处于初级阶段，但这一总体研究方向代表了未来开发真正有效治疗高级别恶性肿瘤的有吸引力的途径。EMT作为肿瘤耐药性的关键因素之一，驱动其发生的因素是肿瘤治疗的一个很有前景的靶点。

基金资助:吴阶平医学基金会临床科研专项基金(编号:320.6750.2020-12-7,320.6750.18555);哈尔滨医科大学附属肿瘤医院海燕科研基金项目(编号:JJZD2019-08);

文章来源:张彦吉,隋红,王凯冰.EMT在肝细胞肝癌耐药中的分子机制研究进展[J].现代肿瘤医学,2024,32(01):172-177.