肝癌是世界第7大常见肿瘤，也是第4大癌症死亡原因[1]。尽管癌症治疗已取得进展，但肝癌的治疗选择有限，患者存活率无显著提高。因此，确定驱动或抑制肿瘤发生的机制对于制订新的肝癌治疗策略至关重要。体细胞在终末分化时保持静止状态，这一过程的变化可导致细胞静止退出和过度增殖，并且参与癌症的发生、发展[2]。多种基因在细胞周期中起至关重要的作用，其表达失调与多种癌症有关，其中PCNA钳位相关因子（PCNA clamp associated factor,PCLAF）基因表达失调与肝癌细胞周期失调并跨越细胞静止相关[3]。慢性丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）感染与肝癌风险增加有关[4]。尽管丙型肝炎能够治愈，但是HCV相关肝癌的死亡人数仍占总肝癌死亡人数的29%[5]。然而，HCV感染是否会影响肝癌细胞静止尚不明确。基于此，本研究旨在探讨HCV通过PCLAF调控肝癌细胞静止的潜在机制。

1、材料与方法

1.1 细胞系

人肝癌细胞HUH7购自浙江美森细胞科技有限公司（货号：CTCC-003-0019），人肝癌细胞BEL-7404购自深圳市优里生物科技有限公司（货号：ylcl-0032）。

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂

α-常春藤皂苷（美国Med Chem Express公司，货号：HY-N0255),DMEM（北京军科弘创生物技术有限公司，货号：AC10003-500m L),Lipofectamine 3000（广州群贤科技有限公司，货号：L3000015),pyronin Y（深圳市优里生物科技有限公司，货号：C5496-10g),7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin,7-ADD）（上海吉至生化科技有限公司，货号：A93190-1mg),RNA提取试剂盒（上海机纯实业有限公司，货号：JLC2093），逆转录试剂盒（昆明云享汇科技有限公司，货号：EZB-RT2GQ),β-actin抗体（沈阳万类生物科技有限公司，货号：WL01372),PCLAF抗体（深圳市优里生物科技有限公司，货号：E-AB-53019）。

本研究所有的si RNA和PCLAF过表达质粒均由北京擎科生物设计合成。对于过表达质粒，根据美国国立生物技术信息中心数据库中PCLAF（序列识别号为NP＿055551.1）和HCV多聚蛋白（序列识别号为NP＿671491.1）的序列进行密码子优化及全基因合成，随后使用无缝克隆法连接至PCDNA 3.1载体（携带Flag标签）。其中，HCV的多聚蛋白总共表达10个蛋白质，分别为核心蛋白（Capsid,C）、包膜蛋白1(Envelop 1,E1）、包膜蛋白2(Envelop 2,E2）、蛋白分子7(Protein 7,p7）、非结构蛋白2(non-structural protein 2,NS2）、非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3）、非结构蛋白4A(non-structural protein 4A,NS4A）、非结构蛋白4B(non-structural protein 4B,NS4B）、非结构蛋白5A(non-structural protein 5A,NS5A）、非结构蛋白4B(non-structural protein 5B,NS5B)[5]。根据蛋白质序列，PCLAF蛋白大小约为28.77 k D,HCV蛋白C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B大小分别约为7.60、20.78、41.07、6.70、21.29、15.42、5.67、19.84、40.89和57.80 k D。si RNA引物序列见表1。

1.2.2 主要仪器

细胞培养箱（上海川宏实验仪器有限公司，型号：CH-180-SQ），流式细胞仪（德国赛多利斯集团，型号：i Que 3),Step One Plus实时PCR系统（美国赛默飞世尔科技公司，型号：4376600），化学发光仪（北京德泉兴业商贸有限公司，型号：AI800）。

表1 si RNA引物序列  

1.3 方法

1.3.1 病毒感染与细胞培养

人肝癌细胞HUH7在高糖Dulbecco´s Modified Eagle's培养基中培养，添加10%胎牛血清、100 nmol/L非必需氨基酸、100 u/m L青霉素和100µg/m L链霉素。细胞在37℃、5%二氧化碳加湿培养箱中培养。传染性HCV JFH-1是通过将体外转录的基因组JFH-1 RNA转染HUH7细胞产生的[6]。HCV JFH-1感染HUH7或BEL-7404细胞时，感染倍数为0.1。将含有PCLAF的质粒（p CMV-PCLAF）或si PCLAF分别转染到HUH7细胞上进行过表达或沉默表达。使用Lipofectamine 3000将质粒或si RNA转染HUH7细胞。研究发现，α-常春藤皂苷可以抑制PCLAF的功能[7]。因此使用α-常春藤皂苷作为PCLAF的抑制剂，并且α-常春藤皂苷处理细胞的终浓度为20µmol/L。

1.3.2 实验分组

HUH7细胞行HCV感染实验，分为两组：Mock组、HCV组。HUH7细胞行HCV感染或不感染后敲低实验，转染各个基因的si RNA后，分为11个亚组：si NC亚组、si TENM1亚组、si MAP3K9亚组、si SESN3亚组、si RAB7B亚组、si GGA3亚组、si CBL亚组、si ZNF501亚组、si MADD亚组、si HADHB亚组、si PCLAF亚组。HUH7细胞行过表达PCLAF实验，分为两组：Vector组、PCLAF组。HUH7细胞行过表达HCV多聚蛋白实验，转染各自过表达质粒，分为11组：Vector组、C组、E1组、E2组、p7组、NS2组、NS3组、NS4A组、NS4B组、NS5A组、NS5B组。HUH7细胞行过表达NS5A的同时敲低PCLAF实验，分为4组：Vector+si NC组、Vector+si PCLAF组、NS5A+si NC组、NS5A+si PCLAF组。对过表达NS5A的同时α-常春藤皂苷处理实验，分为4组：Vector+DMSO组、Vector+α-Hederin组、NS5A+DMSO组、NS5A+α-Hederin组。对HCV感染的同时α-常春藤皂苷处理实验，分为4组：Mock+DMSO组、Mock+α-Hederin组、HCV+DMSO组、HCV+α-Hederin组。

1.3.3 细胞周期分布的检测

用70%乙醇在-20℃条件下固定胰蛋白酶化细胞2 h，磷酸盐缓冲盐水洗涤2次。然后将1×106个细胞重悬，用20µg/m L RNase A和50µg/m L碘化丙啶溶液孵育30 min。采用流式细胞仪检测不同处理组HUH7细胞G0/G1期、S期和G2/期。对于G0期细胞的检测，使用同时期培养的HUH7细胞，用双胸苷阻断法将细胞阻滞在G1/S期。新鲜的乙醇固定细胞与Pyronin Y 1µg/m L和7-氨基放线菌素D 5µg/m L）在37℃条件下作用45 min，流式分选分析将低RNA含量的细胞（低pyronin Y信号）定义为G0细胞。G1期细胞分布定义为G0/G1期细胞分布减去G0期细胞分布。

1.3.4 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）检测PCLAF m RNA的表达

使用通用RNA提取试剂盒从HUH7细胞中提取细胞总RNA。对于RNA-seq，将总RNA交于深圳华大基因科技有限公司进行测序，根据测序结果选取差异表达最大的10个基因进行后续筛选实验。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为c DNA，随后采用SYBR Green PCR Master Mix和Step One Plus实时PCR系统。反应条件：95℃预变性2 min,95℃变性3 s,25℃退火2 min,50℃延伸15 min，共计44个循环，55℃继续延伸30 s。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算PCLAF m RNA相对表达量。q RT-PCR引物序列见表2。 

表2 q RT-PCR引物序列 

1.3.5 Western blotting检测PCLAF蛋白的表达

使用细胞裂解液对HUH7细胞进行裂解，提取总蛋白。蛋白定量变性后，通过SDS-PAGE电泳分离样品，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脱脂乳溶液在室温下阻断膜1 h，与一抗在4℃条件下孵育过夜，然后与酶标二抗在室温下反应1.5 h。免疫反应条带通过Super Signal West Pico化学发光底物显示。用Image J软件测量条带密度。数值归一化为GAPDH。一抗分别为抗GAPDH(1∶2 000）、抗PCLAF(1∶1 000）。二抗分别为辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔Ig G(1∶10 000）和山羊抗小鼠Ig G(1∶50 000）。

1.4 统计学方法

数据分析采用PRISM 6.0统计软件。计量资以均数±标准差（）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 HCV感染抑制肝癌细胞静止

Mock组与HCV组G0期、G1期、S期、G2/M期细胞数量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P<0.05);Mock组G0期、G1期细胞数量均高于HCV组，Mock组S期、G2/M期细胞数量均低于HCV组。见表3和图1。

表3 HCV感染后肝癌细胞的细胞周期分布 

图1 HCV感染后肝癌细胞的细胞周期分布   

2.2 HCV通过PCLAF抑制肝癌细胞静止

Mock组与HCV组TENM1、MAP3K9、SESN3、RAB7B、GGA3、CBL、ZNF501、MADD、HADHB、PCLAF相对表达量比较，经t检验，差异均有统计学意义（P<0.05);Mock组TENM1、MAP3K9、SESN3、RAB7B、GGA3、CBL、ZNF501、MADD、HADHB、PCLAF相对表达量均低于HCV组。见表4和图2。

表4 HCV感染肝癌细胞后基因表达差异  

si NC亚组与si PCLAF亚组G0期细胞数分别为（8.75±0.76）、（15.77±1.60）个/HP，经t检验，差异有统计学意义（t=8.862,P=0.000);si NC亚组G0期细胞数低于si PCLAF亚组。见表5。

人肝癌细胞HUH7中，Vector组与PCLAF组Mock中G0期细胞数量分别为（17.65±1.79）、（8.06±0.95）个/HP，经t检验，差异有统计学意义（t=10.583,P=0.000);Vector组与PCLAF组HCV中G0期细胞数量分别为（8.58±0.90）、（4.90±1.62）个/HP，经t检验，差异有统计学意义（t=4.440,P=0.002);Vecotr组G0期细胞数量高于PCLAF组。

人肝癌细胞BEL-7404中，Vector组与PCLAF组Mock中G0期细胞数量分别为（18.68±2.15）、（8.25±0.93）个/HP，经t检验，差异有统计学意义（t=9.956,P=0.000);Vecotr组G0期细胞数量高于PCLAF组。Vector组与PCLAF组HCV中G0期细胞数量分别为（9.03±0.93）、（5.10±0.59）个/HP，经t检验，差异有统计学意义（t=7.979,P=0.000);Vecotr组G0期细胞数量高于PCLAF组。

图2 HCV感染肝癌细胞后基因表达差异   

2.3 HCV的NS5A调控PCLAF表达影响肝癌细胞静止

11组PCLAF m RNA和蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05);Vector组PCLAF m RNA和蛋白相对表达量均低于NS5A组（P<0.05），见表6和图3。

Vector+si NC组、Vector+si PCLAF组、NS5A+si NC组、NS5A+si PCLAF组的G0期、G1期、S期、G2/M期细胞数量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05);Vector+si NC组G0期、G1期细胞数量均少于Vector+si PCLAF组（P<0.05),Vector+si NC组G0期、G1期细胞数量均多于NS5A+si NC组（P<0.05),Vector+si NC组S期、G2/M期细胞数量均多于Vector+si PCLAF组（P<0.05),Vector+si NC组的S期、G2/M期细胞数量均少于NS5A+si NC组（P<0.05）。见表7和图4。 

表5 HCV感染或不感染后敲低差异表达的基因肝癌细胞的G0期细胞分布  

表6 过表达HCV各个蛋白肝癌细胞PCLAF m RNA和蛋白相对表达量比较  

图3 过表达HCV各个蛋白肝癌细胞PCLAF蛋白的表达  

2.4 α-常春藤皂苷阻断HCV引起肝癌细胞静止

Vector+DMSO组、Vector+α-Hederin组、NS5A+DMSO组、NS5A+α-Hederin组的G0期、G1期、S期、G2/M期细胞数量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05);Vector+DMSO组G0期、G1期细胞数量均少于Vector+α-Hederin组（P<0.05),Vector+DMSO组G0期、G1期细胞数量均多于NS5A+DMSO组（P<0.05),Vector+DMSO组S期、G2/M期细胞数量均多于Vector+α-Hederin组（P<0.05),Vector+DMSO组S期、G2/M期细胞数量均少于NS5A+DMSO组（P<0.05）。见表8和图5。  

表7 过表达或不过表达NS5A与敲低或不敲低PCLAF后肝癌细胞的细胞周期分布 

图4 过表达或不过表达NS5A与敲低或不敲低PCLAF后肝癌细胞的细胞周期分布     

表8 过表达或不过表达NS5A与α-常春藤皂苷或不处理后肝癌细胞的细胞周期分布  

图5 过表达或不过表达NS5A与α-常春藤皂苷或不处理后肝癌细胞的细胞周期分布 Mock+DMSO组、Mock+α-Hederin组、HCV+DMSO组、HCV+α-Hederin组的G0期、G1期、S期、G2/M期细胞数量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P<0.05);Mock+DMSO组G0期、G1期细胞数量均少于Mock+α-Hederin组（P<0.05),Mock+DMSO组G0期、G1期细胞数量均多于HCV+DMSO组，Mock+DMSO组S期、G2/M期细胞数量均多于Mock+α-Hederin组（P<0.05),Mock+DMSO组S期、G2/M期细胞数量均少于HCV+DMSO组（P<0.05）。见表9和图6。

表9 HCV感染或不感染与α-常春藤皂苷或不处理后肝癌细胞的细胞周期分布  

图6 HCV感染或不感染与α-常春藤皂苷或不处理后肝癌细胞的细胞周期分布   

3、讨论

肝细胞癌是全世界最常见的癌症之一，也是病死率第3的癌症[8]。HCV感染是最常见的慢性感染之一，影响着全世界超过7 000万人[9]。慢性HCV感染对肝脏造成慢性损伤，最终导致肝硬化和肝细胞癌[10]。有趣的是，有报道称HCV感染可能使患者易患某些肝外癌症，如甲状腺癌、肾癌和肝癌[11]。因此，了解HCV在癌症发生、发展中的作用对制订新的肝癌治疗策略至关重要。在本研究中，HCV感染后，肝癌细胞G0期和G1期细胞分布减少，而S期和G2/M期的细胞分布增加，提示HCV诱导肝癌细胞跨越G0期静止，减少细胞分裂时间。

本研究结果表明，HCV的NS5A蛋白能够促进肝癌细胞PCLAF m RNA和蛋白表达升高；HCV感染的情况下，过表达PCLAF后肝癌细胞G0期细胞分布减少；同时，敲低PCLAF或PCLAF抑制剂α-常春藤皂苷处理后，HCV诱导肝癌细胞跨越G0期静止的表型受到抑制。因此，HCV通过PCLAF诱导肝癌细胞跨越G0期静止。有研究发现，PCLAF能够使肝癌细胞绕过细胞静止期，促进肺部肿瘤的发生[4]，其促肿瘤作用与本研究结果一致。G0期是细胞处于可逆细胞周期停滞的一种细胞状态[12]。对多细胞来说，G0状态是发育所必需的，在发育谱系不同阶段的细胞，包括干细胞、慢循环细胞和分化的成熟细胞，在时间或空间上都有G0状态[13]。癌细胞跨越G0状态后，突破细胞静止状态，进入快速增殖期是癌症发生、发展的关键[14]。然而，癌细胞也可以共享G0状态，也称为休眠或静止癌细胞[15]。静止的癌细胞是解释临床上观察到癌症休眠的一种机制。虽然停止增殖失控的癌细胞对多细胞生物体是有益的，但处于休眠状态的同一癌细胞可以在大多数化疗和放疗中存活下来，并且随着时间推移，可能获得更多突变，并在重新进入细胞周期时获得转移的潜力[16]。因此，细胞静止稳态的失调是癌细胞发生、发展及规避治疗的关键。在肝癌中，HCV的NS5A蛋白引起PCLAF表达改变是造成肝正常细胞和肝癌细胞静止稳态失调的原因之一。

综上所述，HCV诱导肝癌细胞跨越G0/G1期静止，减少细胞分裂时间。HCV的NS5A蛋白通过提高PCLAF的表达而抑制肝癌细胞静止。PCLAF抑制剂α-常春藤皂苷可以阻断HCV抑制的肝癌细胞静止。

基金资助:四川省科技计划项目(No:2023YFQ0101);

文章来源:罗鸣,杨晋,秦蜀.慢性丙型肝炎病毒对肝癌细胞静止的影响及其机制研究[J].中国现代医学杂志,2024,34(02):45-52.