原发性肝癌（PLC）是常见的恶性肿瘤之一，据统计，2020年全球约有905 700人诊断为PLC，死亡人数达到830 200人，到2050年预计发病例数可达到100万例[1]。肝细胞癌（HCC）是PLC最常见的病理分型，在患有慢性肝病的人群中发病率较高，但由于起病隐匿，早期检出率不高，多数HCC患者发现时已进展至中晚期，错失最佳治疗时机。因此，开发新的生物标志物，对HCC的危险人群进行定期筛查，早期发现与诊断HCC是当前研究的热点。肿瘤中多种发生糖链特异性改变的糖蛋白被确定为HCC的血清学标志物，包括甲胎蛋白异质体（AFP-L3）、高尔基体糖蛋白73(GP73）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3）等；基于这些发现，推测检测糖蛋白质的特定寡糖链对诊断HCC可能具有更高的灵敏度和特异度。本研究纳入2022年1—11月就诊于苏州大学附属第一医院的慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者为研究对象，将非HCC患者按照慢性肝病患者肝癌风险预测模型评分（a MAP评分）[2]划分为低、中、高风险组，检测低风险、中风险、高风险组及HCC患者中寡糖链及甲胎蛋白（AFP）的表达情况，分析两者对HBV相关HCC早期诊断的价值。

1、对象与方法

1.1 研究对象

纳入2022年1—11月就诊于苏州大学附属第一医院的慢性HBV感染患者165例为研究对象，其中非HCC患者123例，HCC患者42例。纳入标准：（1）年龄≥18岁；（2）符合《慢性乙型肝炎防治指南（2022版）》[3]中慢性HBV感染的诊断标准；（3)HCC患者诊断符合以下两项中任一项(1)病理证实为HCC,(2)肝内结节直径≤2 cm，动态增强MRI、动态增强CT、超声造影或肝细胞特异性对比剂钆塞酸二钠（Gd-EOB-DTPA）增强MRI四项检查中至少有两项显示动脉期病灶明显强化、门静脉期和/或平衡期肝内病灶强化低于肝实质，即“快进快出”的肝癌典型特征，肝内结节直径>2 cm,4种影像学检查中存在1项肝癌典型特征；（4）临床资料齐全。排除标准：（1）有其他实体肿瘤或血液系统肿瘤病史；（2）合并其他肝炎病毒感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病、血吸虫肝病；（3）妊娠及合并生殖系统肿瘤；（4）接受手术、介入、靶向或免疫治疗；（5）出现溶血、污染、反复冻融的不合格标本；（6）肝功能衰竭。本研究已通过苏州大学附属第一医院伦理审批委员会审批[批件号：（2022）伦审批第061号]，研究对象均签署了知情同意书。

1.2 数据收集

通过电子病历系统收集患者一般资料（年龄、性别、肝硬化情况）、实验室检查指标[总胆红素（TB）、白蛋白（ALB）、血小板计数（PLT）、AFP]，计算a MAP评分。a MAP评分={0.06×年龄（岁）+0.89×性别+0.48×[lg TB（μmol/L）×0.66+ALB(g/L）×-0.085]-0.01×PLT（×109/L)+7.4}/14.77×100，其中男=1，女=0。使用促凝管留取患者静脉血1～2 m L，室温下静置1 h后，3 000～3 500 r/min离心10 min（最大相对离心力：2 150×g）获得血清样本，置于-20℃冰箱储存。使用寡糖链检测试剂盒（江苏先思达生物科技有限公司，批号：20220816、20221025）检测血清样本的寡糖链，具体步骤如下：（1）寡糖链释放；（2）寡糖链标记；（3）唾液酸去除；（4）寡糖链数据分析[4]。

1.3 分组

将HCC患者作为HCC组（42例），非HCC患者根据a MAP评分进行分组，<50分为低风险组（40例）、50～60分为中风险组（44例）、>60分为高风险组（39例）。

1.4 统计学方法

应用SPSS 27.0统计学软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；非正态分布的计量资料以M(P25,P75）表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，组间两两比较采用MannWhitney U检验；计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验，组间两两比较采用Bonferroni法。绘制受试者工作特征曲线（ROC曲线）分析AFP、寡糖链标志物检测结果（G-Test）及两者联合诊断HCC的效能，计算ROC曲线下面积（AUC），并用De Long检验比较联合指标与单个指标AUC的差异。采用Kappa一致性检验分析AFP、G-Test与临床诊断结果的一致性：Kappa值≤0.20，一致性较差；Kappa值0.21～0.40，一致性一般；Kappa值0.41～0.60，一致性中等；Kappa值0.61～0.80，一致性较高；Kappa值0.81～1.00，一致性高[5]。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 4组患者一般资料及实验室检查指标比较

4组患者年龄、肝硬化比例、TB、ALB、PLT、AFP、G-Test比较，差异有统计学意义（P<0.05），其中HCC组患者AFP、G-Test高于低风险组、中风险组、高风险组，年龄、肝硬化比例高于低风险组、中风险组，ALB低于低风险组、中风险组，TB低于高风险组，PLT低于低风险组，差异有统计学意义（P<0.05）；高风险组患者年龄、TB、G-Test高于低风险组、中风险组，ALB、PLT低于低风险组、中风险组，肝硬化比例高于低风险组，差异有统计学意义（P<0.05）；中风险组患者的年龄、肝硬化比例高于低风险组，PLT低于低风险组，差异有统计学意义（P<0.05）。4组患者性别比例比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.2 AFP、G-Test及两者联合对HCC的诊断价值

绘制AFP、G-Test及两者联合诊断HCC患者的ROC曲线，结果显示AFP和G-Test诊断HCC的AUC分别为0.796(95%CI=0.706～0.886,P<0.001）、0.878(95%CI=0.813～0.943,P<0.001），最佳截断值分别为5.58μg/L和5.06。两者联合诊断HCC的AUC为0.901(95%CI=0.844～0.957,P<0.001）。De Long检验结果显示，联合诊断HCC的AUC高于AFP，差异有统计学意义（Z=2.104,P=0.035），联合诊断与G-Test的AUC差异无统计学意义（Z=1.436,P=0.151),AFP、G-Test及两者联合诊断HCC的ROC曲线见图1。

2.3 AFP、G-Test与临床诊断结果的一致性检验

本研究以AFP≥20μg/L为阳性，<20μg/L为阴性[6];G-Test≥5.06为阳性，<5.06为阴性。一致性分析结果显示，AFP与临床诊断结果的一致率为84.8%(140/165），一致性中等（Kappa值=0.539,P<0.001),G-Test与临床诊断结果的一致率为89.5%(145/165），一致性较高（Kappa值=0.704,P<0.001），见表2～3。

2.4 G-Test对AFP阴性HCC的诊断价值

绘制G-Test诊断AFP阴性HCC的ROC曲线，结果显示，G-Test诊断AFP阴性HCC的AUC为0.895(95%CI=0.839～0.952,P<0.001），最佳截断值为5.06，灵敏度为0.857，特异度为0.878,G-Test诊断AFP阴性HCC的ROC曲线见图2。  

表1 患者的一般资料与临床资料分析    

表2 AFP与临床诊断结果的一致性检验结果    

表3 G-Test与临床诊断结果的一致性检验结果 

3、讨论

肝癌的早期症状隐匿，患者出现肝区不适、肝功能损害、黄疸、消瘦等症状就诊时多数肿瘤已明显进展，出现肝内外转移、淋巴结转移、门脉癌栓等，无法行根治性治疗。为早期发现HCC，提高患者预后及延长生存时间，国际上建立了多种HCC临床预测模型，对HCC风险人群进行分层管理。a MAP评分是我国学者首次提出的应用范围最广泛的肝癌预测模型，在白蛋白-胆红素（ALBI）评分的基础上添加了性别、年龄、PLT等指标，按照分数划分为不同肝癌风险等级的人群（低风险<50分，中风险50～60分，高风险>60分），在不同病因的肝病患者中均具有良好的预测能力，优于其他预测模型，评分<50分的低风险组，HCC的5年发病率为0.8%，评分>50分的高风险组，5年发病率为19.9%[2]。因此，本文分析AFP和G-Test在不同a MAP评分的肝癌风险人群与HBV相关HCC患者中的表达差异，探究新的血清学指标对HCC的诊断价值。

图1 AFP、G-Test及两者联合诊断HCC的ROC曲线   

图2 G-Test诊断AFP阴性HCC的ROC曲线   

N-糖基化在真核和原核生物的生命体内广泛存在，是糖基化最常见的修饰形式。人体内大多数血清N-糖蛋白在肝脏或B淋巴细胞内合成，血清N-聚糖结构和数量的变化可以反映肝脏或B淋巴细胞生理功能的变化。因此，测定血清中N-聚糖谱可用于肝脏疾病的无创诊断。近年来，糖链分离技术的进步使N-聚糖的应用更为广泛，采用不同的分离技术可得到不同的糖链谱，从而获得不同的生物标志物。2010年，FANG等[7]使用二乙基亚硝胺（DENA）构建大鼠肝癌模型，采用DNA测序辅助荧光团辅助碳水化合物电泳（DSA-FACE）技术获得N-聚糖谱进行分析，发现峰P5随着肝纤维化进展逐渐减低，可作为监测DENA大鼠模型纤维化的生物标志物，而R5a与P1的比值和R5b与P1的比值在HCC大鼠中特异性升高，可作为诊断DENA大鼠模型HCC的特异性指标。HIGASHI等[8]采用简化的荧光标记N-聚糖制备方法从血清样本中检测出5个有意义的N-聚糖谱[A2G0、M5A、A2G0B、A2G1(6)FB和A2G2B]，发现丙型肝炎病毒（HCV）感染的HCC组以上N-聚糖谱均显著高于健康对照组、肝炎组和肝硬化组（P均<0.05），证实了N-聚糖是HCV相关HCC的潜在标志物。此外，A2G1(6)FB与AFP、异常凝血酶原（DCP）无明显相关性，可作为AFP、DCP均阴性HCC的良好补充指标。本研究采用DSA-FACE技术获得了165例HBV感染患者血清的寡糖链结果，对比分析结果发现，G-Test在非HCC组中经a MAP评分为低、中、高风险的肝癌风险人群与HCC患者间存在显著差异（P<0.001）；在低/中风险-高风险-HCC疾病进展过程中，寡糖链水平呈升高趋势，高危组显著高于低危组和中危组（P<0.001);HCC患者的G-Test明显高于非HCC患者。因此，寡糖链可能与HCC的发生密切有关，是否可作为预测肝癌发生风险的标志物尚需进一步探讨。

正常生理状态下，AFP由胎儿的卵黄囊和肝脏产生，出生后迅速下降[9]。既往研究在患有HCC小鼠的体内发现AFP升高，证明其为HCC的血清学标志物，随后迅速应用到人类HCC的诊断中[10]。近年来，研究发现AFP的分子糖链具有异质性[11]，在乙酰氨基葡萄糖的氨基还原末端有1～6个岩藻糖残基的亚型被称为甲胎蛋白异质体3(AFP-L3)[12]，此亚型与小扁豆凝集素（LCA）具有良好的结合能力，若患者血清中AFP-L3占AFP总量的百分比（AFP-L3%）≥10%提示为HCC的可能性较大[13]。既往糖蛋白肿瘤标志物的检测更多的是针对蛋白质成分，AFP-L3就聚糖成分进行检测，被发现是诊断HCC更为特异的标志物。因此，疾病中糖链的变化可能早于蛋白质，更具有特异性。本研究将基于N-聚糖测定的G-Test与传统血清学标志物AFP进行比较，发现AFP单独诊断HCC的效能明显劣于G-Test,G-Test是鉴别HBV相关HCC患者和慢性HBV感染患者的优良指标，可作为一种有价值的非侵入性血清学标志物。本研究中联合诊断具有更高的AUC值，De Long检验显示AFP、G-Test联合诊断检出HCC的能力明显高于AFP(P=0.035）。本研究将AFP、G-Test分别与临床诊断结果进行一致性检验，发现AFP与临床诊断结果的一致率为84.8%，一致性为0.539(P<0.001);G-Test与临床诊断结果的一致率为89.5%，一致性为0.704(P<0.001）。与AFP的检测结果相比，G-Test检测结果与临床诊断结果符合率更高。因此，在慢性HBV感染的患者中若检测出G-Test≥5.06，应考虑HCC的可能，进一步完善增强CT/MRI等检查。

与AFP阳性患者相比，AFP阴性的HCC患者肿瘤分化良好、直径更小，常具有完整的肿瘤包膜，肝移植术后往往复发率更低、预后更好[14]。因此，许多学者致力于发现一种优良的血清学标志物，可以从良性肝病（肝硬化、慢性肝炎等）人群中筛选出AFP阴性的HCC。DCP、AFP-L3、高尔基体糖蛋白73(GP73）等已经被确定可用于AFP阴性HCC的诊断和预后评估[15]。LIU等[16]发现DCP可以区分AFP阴性的HBV相关HCC与慢性HBV感染及肝硬化患者。ZHANG等[17]证实AFP-L3和GP73均可作为诊断AFP阴性HCC的生物标志物，50%AFP阴性HCC患者AFP-L3阳性，66%AFP阴性HCC患者GP73阳性。HUANG等[18]采用N-聚糖指纹图谱（NGFP）技术分析血清N-聚糖结构丰度，并运用Logistic回归算法定义了由13个有意义的N-糖基结构组成的生物标志物面板，发现N-聚糖生物标志物与AFP具有良好的互补性，可用于诊断AFP阴性的HCC。因此，进一步分析了G-Test诊断AFP阴性HCC的ROC曲线，发现G-Test对AFP阴性HCC的诊断能力良好，AUC为0.895(95%CI=0.839～0.952,P<0.001），灵敏度、特异度分别为0.857、0.878。因此，可作为诊断AFP阴性HCC的有效血清学标志物。

AFP作为临床最常见的肝癌血清学标志物，单独诊断HCC的准确率并不理想，在急性和慢性肝炎、肝内胆管细胞癌和胚胎源性肿瘤等患者血清中均发现升高的AFP，削弱了对肝癌诊断的特异性。AFP单独诊断HCC的灵敏度为41%～65%[19]，与DCP联合检测可将灵敏度提高到84%[20]。本研究发现G-Test对HBV相关HCC的诊断能力明显优于AFP，具有良好的灵敏度和特异度，与国外多项研究结果相符[21,22]，但由于本研究人群局限为慢性HBV感染患者，在HCV感染、酒精性肝病、自身免疫性肝病等其他病因的肝癌风险人群中的诊断HCC的价值尚需进一步证实。

本研究存在以下局限性：（1）本研究的样本量较少，入组对象均来自同一家医院，存在选择偏倚，可能会对试验结果产生影响；（2）本研究受试者，并非均以病理结果作为诊断依据，尤其是肝硬化患者多以临床资料及影像资料作为诊断标准，可能会使结果出现偏倚。

综上所述，寡糖链作为一种潜在血清学标志物，对HBV相关HCC患者的诊断效能明显优于AFP，并可作为AFP阴性HCC患者的补充标志物。本研究未对HCC患者进行治疗后的随访，无法分析寡糖链与肿瘤预后间的相关性，在后续研究中会进一步就相关问题进行探讨。

作者贡献：张芸负责研究的设计、实施与论文的撰写；张芸、蔡欣奕、丁靖诺负责数据、标本的收集与整理；张芸、吴婷婷、张军利负责数据的统计学处理，图、表的绘制；陆圣威、陈萃英、赵卫峰进行论文的修订；赵卫峰负责文章的质量控制与审查，对文章整体负责，监督管理。

参考文献:

[3]中华医学会肝病学分会,中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南(2022年版)[J].中华肝脏病杂志,2022,30(12):1309-1331.

[5]熊宗璠.配对计数资料的Kappa统计量[J].临床检验杂志,1992(2):101-102.

[6]田州,张建淮.甲胎蛋白诊断和筛查原发性肝癌的阈值分析[J].临床肝胆病杂志,2018,34(11):2352-2355.

文章来源:张芸,蔡欣奕,丁靖诺等.寡糖链､甲胎蛋白对乙型肝炎病毒相关肝细胞癌风险筛查与诊断价值研究[J].中国全科医学,2024,27(15):1855-1860.