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FEN1调节肝细胞癌发生和预后的临床意义

2024-04-22 36 上传者：管理员

摘要：目的分析瓣状核酸内切酶1(FEN1)与肝细胞癌(HCC)发生和预后的关系。方法选取2017年5月至2022年10月我院肝胆外科收治的91例HCC患者的HCC组织(HCC组)和90例肝硬化患者的LC组织(LC组)，采集所有患者术前血清样本。另纳入90例健康志愿者的血清样本作为对照。免疫组织化学法分析组织FEN1表达，酶联免疫吸附试验法检测血清FEN1水平。记录HCC患者5年无病生存期(DFS)和总生存期(OS)。结果 LC组和HCC组患者血清FEN1水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。HCC组织FEN1蛋白表达H评分与血清FEN1水平呈正相关(rs=0.726,P<0.001)。血清FEN1诊断HCC或者鉴别诊断HCC和LC的曲线下面积(AUC)分别为0.943和0.897。血清FEN1水平>244.74 pg/mL为HCC患者5年DFS率和OS率的独立危险因素(P<0.05)。结论 FEN1在HCC组织和血清样本中过表达，并与HCC患者的不良预后呈正相关，可作为HCC患者的早期诊断和预后评估的生物标志物。

关键词：
FEN1
HCC
临床病理特征
瓣状核酸内切酶1
肝细胞癌
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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一[1,2]。寻找能改进筛查、诊断和治疗策略的可靠生物标志物，对于改善HCC患者的预后至关重要。DNA损伤是肿瘤进展的一个重要因素，不适当的DNA修复可导致细胞恶性转化[3,4]。瓣状核酸内切酶1(flap endonuclease 1,FEN1）是一种结构特异性多功能酶，在DNA复制和修复中发挥着关键作用，且与癌症的发展有关[5,6,7,8]。Bian等[8]证实FEN1可增强HCC细胞的增殖能力、细胞周期、迁移能力、侵袭能力、治疗抗性等，推测FEN1可能是协调HCC进展的核心基因。然而，FEN1在HCC中的蛋白表达和功能分析尚缺乏足够的临床评估。因此，本研究通过检测FEN1在HCC患者组织和血清样本中的表达，探讨其与HCC临床病理参数的关联及对预后的作用，以期为FEN1提供循证医学证据支持。

1、资料与方法

1.1 生物信息学数据分析

从癌症基因组图谱（TCGA）基因表达谱数据库中获取369个HCC组织、50个正常肝组织的FEN1mRNA表达，对FEN1进行相关预后分析和相似基因检测。

1.2 临床资料

选取2017年5月至2022年10月我院肝胆外科收治的HCC患者91例，其中男74例，女17例；年龄12～84岁，平均（52.36±12.78）岁。收集HCC患者的临床及病理资料以及肝切除术中的HCC组织（HCC组）。选取肝硬化患者90例，其中男78例，女12例；年龄16～72岁，平均（52.08±11.39）岁，收集肝硬化（liver cirrho‐sis,LC）组织标本（LC组）。所有患者术前收集促凝血样本4 mL，离心后留存血清。同期采集90份健康志愿者的血清样本作为对照组，其中男79例，女11例；年龄25～80岁，平均（51.74±11.14）岁。本研究所有组织样本均经病理学确诊，样本采集前3个月，受试者未接受任何治疗。所有研究对象对本研究均知情同意。本研究经我院临床研究伦理委员会批准（伦审2020第19号）。

1.3 组织FEN1蛋白检测

石蜡包埋切片孵育2 h,3%过氧化氢暴露抗原。将切片与兔抗人FEN1(1∶100,A1175，中国爱博泰克科技有限公司）在4℃下孵育过夜。37℃下使用与HRP结合的二级抗体探测切片1 h，苏木精进行核染色。Image Pro Plus软件用于量化染色强度。染色强度评分：0分为阴性，1分为弱，2分为中等，3分为强。将该分数与阳性染色细胞百分比相乘，得出IHC分数（H评分），分值范围0～300分。

1.4 血清FEN1水平及其他指标检测

术前采集患者血样，离心（3000r/min,4℃，5 min）后于-80℃储存。使用双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（武汉优尔生科技有限公司）检测血清FEN1水平。用AU2700全自动生化仪检测甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）、前白蛋白（prealbumin,PA）、糖类抗原125(carbohydrate antigen 125,CA125）、总胆红素（total bilirubin,TBIL）、谷丙转氨酶（alanine transaminase,ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotrans‐ferase,AST）、谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GLDH）、白细胞计数（white blood cell count,WBC）、血小板计数（platelet count,PLT）、淋巴细胞（lymphocyte,LYM）、白蛋白（albumin,ALB）、肌酐（creatinine,Cr）水平。以血清FEN1=244.74 pg/mL作为临界值，将HCC患者分为低水平亚组和高水平亚组。

1.5 随访观察

中位随访时间为26个月（4～60个月）。通过临床检查、肿瘤标志物、超声、计算机断层扫描或磁共振成像，每3个月检查复发和转移情况。无病生存期（disease free survival,DFS）定义为手术与术后复发或转移的时间间隔；总生存期（overall survival,OS）定义为存活患者手术至死亡或末次随访的时间。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，连续变量进行正态性检验，正态分布资料以均数±标准差（）表示，采用独立样本t检验；偏态分布资料以中位值（IQR）表示，行Mann-Whitney非参数检验；计数资料以率（%）表示，行χ2检验。相关分析采用Spearman秩相关法。建立受试者工作特征（receiver operating charac⁃teristic,ROC）曲线分析血清FEN1对HCC诊断或鉴别诊断的曲线下面积（area under the curve,AUC）。单因素及多因素COX回归分析影响HCC患者DFS及OS的临床因素。Kaplan-Meier曲线评估OS、DFS，对数秩检验（Log-rank）评估曲线之间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 TCGA数据库分析FEN1 mRNA在HCC组织中的表达及其与预后的关系

HCC组织中FEN1 mRNA表达量显著高于正常肝组织，差异有统计学意义（P<0.05），见图1a。HCC组织中FEN1 mRNA高表达组的中位DFS、OS显著短于低表达组，差异有统计学意义（P<0.05），见图1b、c。

2.2 组织FEN1蛋白表达

与LC组相比，HCC组FEN1蛋白表达水平显著升高[H评分：10.00(0.00,50.00)vs.50.00(10.00,100.00）分，Z=-21.824,P<0.001]，见图2。

图1 TCGA数据库分析FEN1 mRNA在HCC组织中的表达及其与预后的关系。

图2 免疫组化染色评估HCC和LC组织中FEN1蛋白阳性表达情况

2.3 血清FEN1水平检测

LC组[60.93(32.37,93.68)pg/mL]和HCC组[242.44(114.47,384.21)pg/mL]血清FEN1水平均高于对照组[20.27(12.23,31.03)pg/mL]，其中HCC组升高最显著，3组比较差异有统计学意义（H=181.480,P<0.001）。Spearman秩相关性分析显示，HCC组织FEN1蛋白表达H评分与血清FEN1水平呈正相关（rs=0.726,P<0.001）。

2.4 ROC曲线分析

ROC曲线分析结果显示，血清FEN1诊断HCC的AUC为0.943(95%CI:0.917～0.969),cut-off值为100.07 pg/mL，敏感度及特异度分别为79.1%、91.7%。血清FEN1用于HCC和LC鉴别诊断的AUC为0.897(0.852～0.941），见图3。

2.5 血清FEN1水平与HCC患者临床及病理特征的关系

HCC患者血清FEN1水平的中位值为244.74 pg/mL。与低水平亚组比较，高水平亚组（血清FEN1>244.74 pg/mL）患者TNM分期和BCLC分期更高，肿瘤分化程度级别更高（P<0.05），见表1。

图3 ROC曲线

表1 不同血清FEN1水平与HCC患者临床及病理资料比较

2.6 Kaplan-Meier生存曲线分析

91例HCC患者中，共81例（89.01%）在随访期间发生HCC复发或转移，5年OS率为28.57%(26/91）。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，血清FEN1高水平亚组的中位DFS[17(4～50）个月vs.24(4～54）个月]及中位OS[25(8～60）个月vs.31(7～60）个月]显著短于低水平亚组，经Log-rankχ2检验，高水平亚组患者5年DFS率（χ2=4.629,P=0.031）和OS率（χ2=6.067,P=0.014）较低水平亚组更低，见图4、5。

2.7 单因素及多因素COX回归分析

经单因素及多因素COX回归分析，血清FEN1水平>244.74 pg/mL为HCC患者5年DFS率的独立危险因素（P<0.05）；最大肿瘤直径≥5 mm、血清FEN1水平>244.74pg/mL为患者5年OS率的独立危险因素（P<0.05），见表2、3。

3、讨论

由于HCC的高病死率，开发新的诊断生物标志物对于临床筛查和预测高危人群的预后尤为重要[9]。本研究结果显示，与健康志愿者相比，HCC患者血清和组织中FEN1表达显著升高，ROC曲线证实血清FEN1可有效诊断HCC;HCC患者血清FEN1水平升高与更高的临床分期和肿瘤分化程度显著相关；血清FEN1水平较高的HCC患者5年OS和DFS更短，血清FEN1水平高被确定为HCC的独立危险因素。推测血清FEN1可能是HCC诊断和预后预测的良好候选生物标志物。

图4 血清FEN1水平与HCC患者5年DFS率的Kaplan-Meier生存曲线

图5 血清FEN1水平与HCC患者5年OS率的Kaplan-Meier生存曲线

Li等[10]研究中开发了一个与DNA修复过程相关的七个基因（包括FEN1）风险标记，可以预测HCC患者的生存预后。FEN1是一种结构特异性核酸酶，在多种DNA代谢途径和基因组稳定性的维持中起重要作用[5,8]。DNA修复维持基因组完整性是健康细胞稳态的重要组成部分。研究表明，FEN1在DNA复制和修复中具有双重功能，其表达水平紊乱可导致癌症发展[11]。FEN1维持基因组稳定性的作用途径主要包括：①与不同伴侣蛋白构建复合物[12]；②在DNA损伤过程中，FEN1定位于细胞核可保持复制核糖体DNA组织结构的稳定性；③FEN1磷酸化、甲基化和乙酰化蛋白质的能力有利于调节核酸酶、伴侣蛋白的活性[13]。当FEN1发生异常突变时，其表达或功能会发生改变，可导致正常细胞恶性转化或增加患者对致癌物或环境的易感性[14,15]。

表2 单因素分析HCC患者5年DFS率及OS率的影响因素

表3 多因素COX回归分析影响HCC患者5年DFS率及OS率的影响因素

此外，FEN1在体外可促进肝癌细胞迁移和侵袭，在体内可加速异种移植物肿瘤生长和肺转移[16]。Lu等[17]研究也发现FEN1在HCC组织及细胞中异常升高，其表达水平也与肿瘤大小、远处转移和血管浸润相关，本研究结果与之基本一致。本研究ROC曲线结果显示，血清FEN1水平诊断HCC或鉴别诊断HCC和LC的AUC分别为0.943和0.897，且诊断特异度超过90%，表明血清FEN1具有很高的诊断效力，能够区分HCC患者和健康人群以及鉴别诊断HCC和LC。高水平亚组（血清FEN1>244.74 pg/mL）患者TNM分期和BCLC分期更高（P<0.05），证明FEN1水平与肿瘤分化等级相关。但其可否成为临床候选指标尚需要进一步大样本数据验证。此外，FEN1的过度表达与非小细胞肺癌[7]、乳腺癌[6,18]以及肺腺癌[19]的不良预后相关。本研究发现血清FEN1高表达的HCC患者5年OS率和DFS率更低，且血清FEN1高水平也是HCC患者预后的独立危险因素。结合之前的基础研究，推测FEN1在HCC中的作用的潜在机制可能是调节细胞周期和DNA复制途径，而这也可能是影响HCC患者临床预后的主要原因之一。

总之，FEN1在HCC组织和血清中高表达，血清FEN1对HCC的诊断及预后均有一定价值，有利于HCC的早期诊断及预后评估。但本研究未比较FEN1和传统肿瘤标志物（如AFP）对HCC诊断的敏感度及特异度，将在今后的研究中进一步评估FEN1和AFP的单独检测价值以及联合检测价值，以提高诊断效率。

参考文献:

[1]周永婕,王正峰,严俊,等.术前乳酸脱氢酶/白蛋白比值联合AFP评估肝细胞癌患者预后的价值[J].肿瘤防治研究,2022,49(4):347-351.

[3]贾兰兰,王依依,华跃进,等.程序性翻译后修饰对FEN1功能调控的研究进展[J].核农学报,2020,34(6):1205-1212.

[11]邱秀芹,史崔颖,孙洪芳,等.分枝结构特异性内切酶-1(FEN1)突变体N266D表达纯化及功能分析[J].生物学杂志,2021,38(4):34-37.

文章来源:赵建红,岑红兵,杨志勇,等.FEN1调节肝细胞癌发生和预后的临床意义[J].局解手术学杂志,2024,33(04):349-354.