肺癌已成为全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占肺癌的85%[1]。大多数NSCLC患者确诊时处于晚期，治疗难度较大，因此迫切需要进一步探讨NSCLC的发病机制，寻找早期诊断的生物标志物和新的治疗靶点[2]。环状RNA(circularRNAs,circRNAs）与人类癌症的发展密切相关[3]。circAGFG1被证明在NSCLC等许多恶性肿瘤中发挥促癌作用[4]。微小核糖核酸（microRNAs,miRNAs）参与调节与肿瘤发生有关的基因表达，被视为NSCLC的一种潜在治疗靶点[5]。研究证明，NSCLC细胞系中miR-374a-5p表达降低，过表达miR-374a-5p可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移[6]。生物信息学显示，circAGFG1及血管内皮生长因子C(vascular endothe‐lial growth factor C,VEGFC）均与miR-374a-5p存在结合位点，但circAGFG1能否通过调节miR-374a-5p/VEGFC轴参与NSCLC的发展尚未可知，因此，本研究探讨circAGFG1调节miR-374a-5p/VEGFC轴对NSCLC生物学行为的影响，现报道如下。

1、材料与方法

1.1 细胞及组织

收集2021年5月至2022年8月我院收治的55例NSCLC患者的癌组织和癌旁组织，并由组织病理学确认，随后将样品储存在-80°C冰箱中备用。组织标本采集均经患者同意，本研究经我院医学伦理委员会批准（2141962543）。

人支气管上皮细胞系（BEAS-2B）以及人NSCLC细胞系（HCC827、H1975、A549、H1299）由美国典型培养物保藏中心提供，将其置于90%DMEM培养基中，培养于37℃、5%CO2的恒温培养箱。

1.2 主要材料

DMEM培养基（美国Gibco公司）；PrimeScript RT试剂盒（大连Takara公司，批号：RR047A);TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：MT0006);TRIzol®试剂（赛默飞世尔科技公司，批号：15596018);circAGFG1小干扰RNA(si circAGFG1）及阴性对照（si NC）、miR-374a-5p抑制物（miR-374a-5p inhibitor）、miR-374a-5p模拟物（miR-374a-5pmimics）及相应阴性对照物（inhibitor NC、mimics NC）由百奥迈科生物技术有限公司提供；Lipofectamine 3000试剂盒（美国Invitrogen公司，批号：L3000-015);CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司，批号：CK04);Matrigel（美国Sigma公司，批号：356234）；龙胆紫（武汉鲜保生物技术有限公司）；双荧光素酶报告基因载体（广州辛颖有限公司）；增殖蛋白Ki-67、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9）一抗（英国Abcam公司，批号：21700、76003）。

1.3 qRT-PCR检测组织和细胞中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC mRNA表达水平

使用TRIzol®试剂分离培养细胞及组织中总RNA，使用PrimeScript RT试剂盒和TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒获取DNA模板。参照GoTaq qPCR Master Mix说明书在Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行qRT-PCR。以GAPDH和U6作为内部参照，根据2-ΔΔCt法分别计算circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC mRNA相对表达量，引物序列见表1。  

表1 qRT-PCR引物序列  

1.4 细胞分组及处理

待A549细胞融合至80%左右时，将其分为对照组（不做任何处理）、si circAGFG1组（转染si circAGFG1）、si NC组（转染si NC）、si circAGFG1+miR-374a-5p inhibitor组（共转染si circAGFG1与miR-374a-5p inhibitor）、si circAGFG1+inhibitor NC组（共转染si circAGFG1与inhibitor NC）。48 h后进行后续实验。

1.5 CCK-8法检测各组A549细胞活力

将A549细胞以5×103个/孔的密度接种到96孔板中。经上述分组处理后，在37℃下培养0、24、48 h，加入CCK-8试剂，于37℃的培养箱中培养2 h，使用酶标仪在450 nm处检测光密度（optical density,OD）值。

1.6 Transwell实验检测细胞迁移、侵袭

将A549细胞饥饿12 h，然后悬浮在不含血清的培养基中。将100μL细胞悬浮液加至用50μL Matrigel包被（侵袭实验测定）或无Matrigel（迁移实验测定）的上室中。随后下室中加入600μL含10%胎牛血清的培养基。将Transwell平板置于37℃的培养箱中培养24 h，并用0.05%龙胆紫对转移的细胞进行染色。对5个随机区域中的迁移或侵袭细胞进行计数和分析。

1.7 miR-374a-5p与circAGFG1、VEGFC的靶向关系验证

将包含miR-374a-5p结合位点的circAGFG1或VEGFC的部分序列插入到pGL3质粒中，构建circAGFG1 WT或VEGFC WT。circAGFG1或VEGFC定点突变后的序列也被克隆到pGL3质粒中，构建circAGFG1 MUT或VEGFC MUT。将120 ng荧光素酶质粒与40 nmol/L miR-374a-5p mimics或mimics NC转染48 h后，观察荧光素酶活性。

1.8 Western blot检测VEGFC、Ki-67、MMP-9蛋白表达水平

RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，BCA蛋白检测试剂盒进行定量，将等量的总蛋白裂解物（20μg）通过15%SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上，非特异性结合封闭后，将膜与VEGFC、Ki-67、MMP-9一抗（1∶1 000）在4℃孵育过夜，然后加入二抗（1∶5 000）于室温下孵育1 h，凝胶成像观察结果并拍照。

1.9 统计学分析

采用SPSS 26.0软件分析数据，数据以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，进一步行SNK-q检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 组织及细胞中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFCmRNA表达水平

与癌旁组织相比，癌组织中circAGFG1、VEGFC mRNA表达水平显著升高（P<0.05),miR-374a-5p表达水平显著降低（P<0.05），见表2。  

表2 癌组织及癌旁组织中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC-mRNA表达水平  

与BEAS-2B细胞相比，HCC827、H1975、A549、H1299细胞中circAGFG1、VEGFC mRNA表达水平显著升高（P<0.05),miR-374a-5p表达水平显著降低（P<0.05），其中A549细胞变化最为显著，因此将其作为后续研究对象，见表3。  

表3 细胞中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC mRNA表达水平  

2.2 各组A549细胞的细胞活力变化

与对照组、si NC组相比，si circAGFG1组培养24 h、48 h的OD450值显著降低（P<0.05）；与si circAGFG1+inhibitor NC组相比，si circAGFG1+miR-374a-5p inhibitor组培养24h、48h的OD450值显著增加（P<0.05），见表4。 

表4 A549细胞中细胞OD450值  

2.3 各组A549细胞中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC mRNA表达水平

与对照组、si NC组相比，si circAGFG1组circAGFG1、VEGFC mRNA表达显著下降（P<0.05),miR-374a-5p表达显著升高（P<0.05）；与si circAGFG1+inhibitor NC组相比，si circAGFG1+miR-374a-5p inhibitor组VEGFC mRNA表达显著升高（P<0.05),miR-374a-5p表达显著降低（P<0.05),circAGFG1无显著变化（P>0.05），见表5。  

表5 A549细胞中circAGFG1、miR-374a-5p、VEGFC mRNA表达水平 

2.4 各组A549细胞的侵袭、迁移能力

与对照组、si NC组相比，si circAGFG1组细胞侵袭数、迁移数显著减少（P<0.05）；与sicircAGFG1+inhibitor NC组相比，si circAGFG1+miR-374a-5p inhibitor组细胞侵袭数、迁移数显著增加（P<0.05），见图1、表6。

2.5 miR-374a-5p与circAGFG1、VEGFC的靶向关系验证

Starbase数据库显示，circAGFG1、VEGFC分别与miR-374a-5p存在结合位点，见图2、3。miR-374a-5p mimics+circAGFG1 WT组荧光素酶活性较mimics NC+circAGFG1WT组显著降低（P<0.05);miR-374a-5p mimics+VEGFCWT组荧光素酶活性较mimicsNC+VEGFC WT组显著降低（P<0.05），见表7、8。

图1 细胞侵袭、迁移能力（×200)  

2.6 A549细胞中VEGFC、Ki-67、MMP-9蛋白表达水平

与对照组、si NC组相比，si circAGFG1组VEGFC、Ki-67、MMP-9表达显著降低（P<0.05）；与si circAGFG1+inhibitor NC组相比，si circAGFG1+miR-374a-5p inhibitor组VEGFC、Ki-67、MMP-9表达显著升高（P<0.05），见图4、表9。  

表6 A549细胞中侵袭数、迁移数  

图2 数据库预测circAGFG1与miR-374a-5p的结合位点   

图3 数据库预测VEGFC与miR-374a-5p的结合位点     

表7 circAGFG1与miR-374a-5p的靶向关系验证    

表8 VEGFC与miR-374a-5p的靶向关系验证 

图4 A549细胞中VEGFC、Ki-67、MMP-9蛋白表达水平    

表9 A549细胞中VEGFC、Ki-67、MMP-9表达比较  

3、讨论

肺癌已成为全球癌症相关死亡的主要原因，发病率和病死率呈上升趋势，大多数肺癌患者诊断时已为中晚期，治疗效果和预后较差[7]。故有必要探索和了解NSCLC发生发展的分子机制，以改善NSCLC患者的预后。

circRNAs被认为是许多癌症发展中强有力的调节因子，可作为癌基因或肿瘤抑制因子调节细胞行为，包括NSCLC在内的各种癌症的进展[8]。circAGFG1作为circRNAs的一员，与多种肿瘤的发展有关，如circAGFG1可通过靶向miR-370-3p/RAF1轴促进宫颈癌的发展[9];circAGFG1通过调节miR-203/ZNF281轴促进NSCLC的生长和转移，可作为治疗NSCLC的新靶点[10]。本研究结果显示，NSCLC癌组织及细胞系circAGFG1表达较癌旁组织及BEAS-2B细胞显著上调，提示circAGFG1异常表达可能与NSCLC的发展有关，与Ma等[4]的研究结果相符。干扰circAGFG1后，A549细胞活力、迁移能力、侵袭能力及相关蛋白Ki-67、MMP-9表达均显著降低，提示干扰circAGFG1表达可抑制A549细胞的恶性生物学行为发展。

大量miRNAs被证实参与调控NSCLC的进展[11]。生物信息学预测circAGFG1与miR-374a-5p存在结合位点，本研究经双荧光素酶报告基因实验证实了两者的靶向关系。miR-374a-5p在癌症进展中可作为癌基因，也可作为肿瘤抑制因子。在乳腺癌研究中，miR-374a-5p发挥促癌作用，上调其表达可促进乳腺癌细胞的增殖和迁移[12]，但在食管鳞状细胞癌中其表达减少则发挥抑癌作用[13]。miR-374a-5p异常表达与肺癌术后复发相关，预测miR-374a-5p可作为手术后复发的生物标志物应用于临床[14]。本研究结果显示，NSCLC癌组织及细胞系中circAGFG1表达较癌旁组织及BEAS-2B细胞显著下调，miR-374a-5p inhibitor可逆转干扰circAGFG1对A549细胞恶性发展的抑制作用，表明干扰circAGFG1可能通过靶向负调控miR-374a-5p抑制A549细胞的恶性发展。VEGFs是一个重要的生长因子家族，参与调节血管生成和淋巴管生成，而VEGFC被认为与肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种癌症的上皮间质转化及侵袭、迁移有关，且呈现不同程度的高表达[15,16]。VEGFC作为miR-374a-5p下游靶基因，被证明与肺癌的发展密切相关。Duan等[17]的研究表明，增加VEGFC表达可促进NSCLC的转移。赵丽霞等[18]的研究发现，VEGFC在肺癌细胞中表达上调，下调其表达可抑制H1299细胞的恶性生物学行为发展。本研究结果显示，circAGFG1及VEGFC在NSCLC组织及细胞系中表达上调，miR-374a-5p表达下调，干扰或沉默circAGFG1可抑制NSCLC的发展，且circAGFG1与miR-374a-5p、miR-374a-5p与VEGFC存在靶向负调节关系，因此干扰或沉默circAGFG1可上调miR-374a-5p表达，进而抑制VEGFC表达发挥作用。

综上，干扰circAGFG1可抑制A549细胞的恶性生物学行为发展，可能与调控miR-374a-5p/VEGFC轴有关。但本研究仅从单一细胞株及体外实验进行验证，后续将开展多种细胞株及动物体内实验进行深入研究以完善结论。

参考文献:

[15]牛虹,周浩本,刘怀民,等.微小RNA-507靶向调控VEGFC表达及对肝癌细胞生物学行为和PI3K/Akt通路的影响[J].临床肿瘤学杂志,2018,23(8):673-679. doi:10. 3969/j. issn. 1009-0460.2018. 08. 001

[18]赵丽霞,任成波,翟明慧,等. miR-374b-5p靶向VEGFC对肺癌细胞迁移,侵袭及上皮-间质转化的影响[J].中国老年学杂志,2022,42(22):5593-5598. doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202.

基金资助:河北省医学科学研究课题计划(20190907);

文章来源:杨燕君,董跃华,高永山,等.circAGFG1对非小细胞肺癌生物学行为的影响机制研究[J].局解手术学杂志,2024,33(04):306-311.