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骨缺损动物模型的研究进展

2021-09-17 253 上传者：管理员

摘要：骨缺损达到一定范围及距离后,机体自身无法自行修复,即临界骨缺损,需自体骨移植、异体骨移植或骨组织工程进行修复。骨缺损动物模型常被用以评估骨组织工程中骨替代生物材料的再生能力。本文概述了近年来常用的动物骨缺损模型和目前可应用的研究方向,并阐述了口腔相关动物骨缺损模型的现状。

关键词：
临界骨缺损
动物模型
异体骨移植
骨替代生物材料
骨组织修复工程
骨缺损
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炎症、创伤、癌症或先天畸形等可能导致严重的骨缺损。近年来，人工制备的生物材料逐渐成为了新型的骨组织替代物，在骨组织工程中应用广泛。有许多动物模型被用来评估骨替代生物材料的再生能力[1]。在选择特定的动物作为实验模型时，必须考虑各种因素。首先，动物模型的生理及病理机制可与人类类比。其次，可在相对较短的时间段内操作和观测多个研究指标，其他考虑因素包括实验成本、研究目的等[2]。

根据骨缺损的原因，骨缺损可分为3类：机械性骨缺损、炎症性骨缺损和肿瘤性骨缺损。本文讨论了近年来常用的动物骨缺损模型和它们可应用的研究方向，并阐述了口腔相关常用骨缺损模型。

1、机械性骨缺损

机械性骨缺损可用于模拟创伤或手术导致部分骨受损或缺失的情况。依据骨缺损的部位，机械性骨缺损主要有4种类型：颅骨缺损、长骨节段性缺损、部分皮质缺损和松质骨缺损模型，其中颅骨缺损和节段性骨缺损在文献中描述和应用最广泛[3]。

1.1 颅骨缺损模型

颅骨是研究原位骨愈合最常用的手术部位之一，动物首选小型啮齿类动物，如小鼠、大鼠。以大鼠为例，研究者多利用低速(≤1500rpm)无菌环形钻头在大鼠颅骨表面制造圆形缺损，不干扰硬脑膜[4],缺损直径≤6mm一般在双侧顶骨处钻孔；直径>6mm一般以矢状缝为中心进行钻孔。

在构建骨缺损模型时，诱导的缺损大小至关重要[5]。临界骨缺损指在自然状态下终生或在实验周期内不能自行达到骨性愈合。大鼠颅骨中最常用的临界骨缺损直径为5～8mm[4]。一般认为，这种5mm骨缺损的优点是每只动物能诱发两个缺陷，避免跨越矢状缝。然而，Hollinger等[6]发现5mm的骨缺损在13个月的观察期内，显示了10%左右的新生骨形成，未达到公认的临界骨缺损标准。但创建8mm的大鼠颅骨缺损需要侧方开颅入路，这可能会损害局部再生过程，并损害骨的整体愈合[7]。

颅骨缺损模型在研究中应用广泛，是可用组织学和放射学分析的标准化骨缺损，可用于评估骨组织工程生物材料之间的差异，缺点是无法评估生物材料在生理力学载荷下的性能[7]。

1.2 长骨节段性缺损

包括骨折和截骨两种模型，最早由Bonnarens等[8]报道。在后续的研究报道中，主要为截骨法构建，即用钻或锯从预定部位截取部分长骨[9]。可用于长骨节段性缺损动物模型的动物有大鼠、猪、犬、绵羊等[10],其中最常用的动物是绵羊，成年绵羊具有与成人相似的体重和骨重塑率以及适合的尺寸[11],因而易将研究结果转化应用于临床。

一般认为长骨的临界骨缺损值应为长骨干直径的2～2.5倍[1]。除骨缺损大小外，长骨节段性缺损还要考虑其他因素，如动物的年龄和种类、骨缺损部位、骨结构、动物的全身状况等，并且需要遵循3R原则，即替代(replacement)、减少(reduction)和优化(refinement)。根据实验成本及研究目的等综合考虑，选择合适的动物种类和骨缺损的部位，选择生理发育均较稳定的年龄段动物，并且保持动物良好的全身状况，在不影响实验要求和实验结果的基础上科学利用和合理保护动物。

1.3 部分骨缺损

在节段性骨缺损模型中，一般是较大且完全穿透的骨缺损。而在部分缺损模型中，通常用器械钻入骨的侧面以形成受伤区域。钻孔穿透皮质骨，可以延伸到下面的松质骨或骨髓腔。在这个模型中，通常只有一侧骨头受伤[12]。

部分皮质骨缺损操作简单，并能模拟稳定型骨折愈合的步骤，与其他闭合性和开放性骨折相比有许多优点[12],如降低动物的发病率，并更利于组织形态计量学分析。常见部位为长骨骨干中部或干骺端，根据所用动物和部位的不同，缺损直径从0.8～5mm不等[13]。

1.4 口腔相关机械性骨缺损

在口腔和颌面外科领域测试创新的骨再生疗法，尤其是在将骨再生材料应用于牙周治疗的情况下，有必要克服牙周手术特有的解剖学障碍，因此通常应用动物的牙周和下颌骨缺损模型，包括骨上皮缺损、牙周开窗缺损、人为分叉缺损、引导性骨再生缺损，以及下颌骨的节段性缺损[14]。颌骨缺损模型既要满足临界尺寸缺陷的主要特征，也要便于制造缺损与观测指标。对于颌骨建模的部位与方式，基于研究目的和建模动物种类的不同常有不同的选择，缺损形状及大小也存在差异。此外，在口腔中，牙齿的缺失导致颌骨丧失咬合力的刺激，导致牙槽突的吸收。因此也有实验联合拔牙与机械性骨缺损来制造牙周骨缺损模型[15]。

在建模动物方面，大鼠、兔、猪、犬均有文献报道[14,15,16]。猪下颌骨在大小、解剖学、形态、功能、新陈代谢和血液供应方面与人类下颌骨相似，再生率也在与人类的相似，程度上超过狗。研究发现猪下颌角区无颊骨膜的5cm3缺损是合理的临界缺损模型[16]。

2、炎症性骨缺损模型

炎症性骨缺损是指骨缺损的同时伴有炎症，炎症常导致骨坏死、骨折延迟愈合、骨不连以及内置物植入的失败，其治疗是临床研究热点。炎症性骨缺损动物模型的建立为其提供了有效的研究方法，可为解决相应临床问题提供宝贵的理论基础。目前大多数实验采用在慢性骨髓炎模型的基础上清创制造骨缺损的方法构建炎症性骨缺损模型[17]。

2.1 建模方式

2.1.1 细菌感染

与临床感染相同，感染性骨缺损动物模型最常采用金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)。常用菌株为美国典型培养物保藏中心(ATCC)菌株[18],或根据实验需要选择不同抗生素敏感型S.aureus[19]。文献报道中常见的接种途径为骨髓腔内局部接种，一种方法是在骨钻孔后直接注入细菌悬液，所使用的细菌悬液浓度一般为108集落形成单位(colony-formingunits,CFU)/mL,105～108CFU/mL均见报道[18]。另一种方法是将含菌混凝块，或异物、金属丝等浸泡菌悬液后植入骨内[20]。实验前根据实验动物及建模部位确定细菌的接种浓度尤为必要，否则可能导致感染率过低或动物病死率过高。一般均只接种1次，接种后视炎症的的急性程度，可在6h(急性感染)或1～4周(慢性感染)内对创面进行手术清创并进行相应的处理或骨缺损的评估[21]。

2.1.2 局部炎症

常见的是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的颅骨局部炎症性骨缺损，将LPS注射到颅骨周围组织袋内，靠近颅骨中线的耳眼之间，5～7d后即可产生明显骨缺损，LPS常用浓度为25～50mg/kg[22]。此外也有使用白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)诱导骨缺损[23]。此方式相较细菌感染操作更为简便。

2.2 量化缺损

术后检测诊断或评估炎症性骨缺损的严重性主要依据放射学和组织学检查。临界骨缺损概念不适用于炎症性骨缺损模型。因为炎症性骨缺损模型的影响因素很多，如菌株不同、免疫缺陷等。即使相同的菌株和接种浓度，在不同动物同一部位构建的炎症性骨缺损模型差异也很大。所以炎症性骨缺损模型很难量化，各研究间难以进行横向比较。

2.3 口腔相关炎症性骨缺损

在口腔相关研究中，修复牙周炎和慢性根尖周炎造成的骨缺损是较为热门的研究方向。由于牙周炎的病因和牙周微环境的复杂性和特殊性，建立动物实验性牙周炎骨缺损模型的主要方式为通过龈下注射LPS或结扎丝结扎牙颈部等诱导炎症的发生，辅以高糖饮食等，1～4周可造成牙槽骨骨量下降，也有实验在此基础上通过机械清除颊骨和牙槽嵴制造临界缺损[24,25]。术后可通过放射学和组织形态学检查评估骨缺损。为模拟慢性根尖周炎发生的病因，常见建模方式是暴露动物的牙髓以诱发根尖周病，使用球钻去除磨牙的髓顶后，不封闭牙齿，使牙髓暴露于口腔环境中[26]。一般4周后可形成根尖周骨吸收。此外，有实验使用细菌建模以研究特定菌群造成的根尖周病[27]。

3、肿瘤性骨缺损

肿瘤和癌症骨转移对人类健康构成严重威胁，开发一种兼具抗肿瘤和骨再生功能的植入物势在必行。许多材料抑制肿瘤和骨再生的能力是分别测试的，因此迫切需要合适的动物模型来同时评估这两种功能。肿瘤性骨缺损一般为局部移植肿瘤组织或注射肿瘤细胞悬液造成的骨侵袭模型，也有研究在此基础上辅以机械性骨缺损。

3.1 骨侵袭模型

异种移植的小鼠骨肿瘤模型主要包括直接接种到骨中或在心内注射后自发的骨扩散[28],前者在目前研究中更为多见。根据所研究的肿瘤不同，选用不同的细胞系建模，接种的部位也有所不同，常用接种方式为胫骨平台或骨髓腔内接种，形成骨缺损的时间从1周到4周均有报道[29,30]。

3.2 骨肿瘤伴机械性骨缺损

除肿瘤骨侵袭模型外，也有实验采用骨肿瘤伴机械性骨缺损的方式。如Zhang等[31]在兔股骨中段用电锯造成15mm长的节段性缺损，用兔恶性肿瘤VX2细胞混悬液注射支架，并通过螺钉钢板固定到所产生的骨缺损中，以便更好地研究在肿瘤环境中设计和应用植入物修复节段性骨缺损。

3.3 口腔相关肿瘤性骨缺损

鳞状细胞癌是口腔中最常见的恶性肿瘤，也是口腔常见的肿瘤性骨缺损模型。常见的鳞癌局部骨侵袭模型具体操作为将SCC细胞(5×106/100μL)皮下注射于裸鼠颅骨覆盖区，术后4周即有明显骨破坏[29]。也有文献报道将鳞状细胞癌细胞接种于胫骨干骺端，建立口腔鳞状细胞癌骨侵袭模型[32]。与机械性骨缺损相似，为了更好地模拟口腔颌面部肿瘤，颌骨也是口腔中肿瘤性骨缺损常见的建模部位[33]。

4、总结与展望

骨缺损动物模型的建立要考虑多方面因素。一个成功的骨缺损动物模型，需要满足实验目的，提供实验所要观察和收集的指标数据，并能将实验结果转化应用于临床。目前骨缺损动物模型应用广泛，其中许多骨缺损动物模型可用于口腔相关研究方向，但仍需要更进一步的研究，直到实现标准化的模型，从而消除或最小化所有不确定因素。

参考文献:

[1]严霞,张亚楠,孟增东.构建骨缺损植入材料非人灵长类动物模型的研究与进展[J].中国组织工程研究,2018,22(31):5021-5026.

[24]柯晓菁,雷浪,闫福华.LP-17多肽对牙龈吓啉单胞菌脂多糖致牙周炎进展的作用[J].口腔医学研究,2018,34(3).323-326.

文章来源：卢嘉蕊,权晶晶.骨缺损动物模型的研究进展[J].口腔医学研究,2021,37(09):783-786.