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基于单细胞拉曼技术的口腔病原微生物快速鉴别研究

2021-09-17 183 上传者：管理员

摘要：目的:评价单细胞拉曼技术对3种口腔病原微生物的快速分类效能。方法:（1）培养变异链球菌UA159、白色念珠菌ATCC10231和粪肠球菌ATCC29212至稳定期,绘制生长曲线评估生长状态;（2）测量对数和稳定期菌株单细胞拉曼图谱,使用主成分和随机森林分析方法分析光谱。结果:（1）3个菌株的对数期和稳定期均可被拉曼技术快速区分。准确率分别为:99.6%、99.86%、99.60%;（2）单细胞拉曼技术能够快速精确区分稳定期的3种实验菌株,准确率高达99.68%;（3）通过随机森林算法分析得到3种稳定期实验菌株之间的拉曼差异峰分别为:1126～1128cm-1、736～744cm-1、1330～1440cm-1、778～785cm-1、1001～1003cm-1和1431～1481cm-1。其生物学标志分别为:蛋白质、胸腺嘧啶、脂质、胞嘧啶、尿嘧啶、苯丙氨酸、蛋白质。结论:单细胞拉曼光谱可高效区分物种的生长时期和菌株类别。

关键词：
主成分分析
单细胞拉曼
口腔病原微生物
微生物结构
随机森林
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口腔病原微生物与人体健康状态息息相关[1,2],而临床感染源的快速、精准检测对患者的及时治疗以及降低感染风险至关重要。虽然细胞的形态学和理化特征已经成为目前微生物检测与鉴定技术的金标准[3],但仍存在诸多技术缺陷：如依赖细胞群体水平，检测周期长[4];绝大多数(>99%)微生物无法常规培养[5];分子生物学方法如聚合酶链反应、全基因组测序、基因芯片[6,7]等虽灵敏但会破坏微生物结构，难以检测原位状态下低丰度的病原微生物，耗时费力的同时也不利于多样本的快速分析[4,8]。基于单细胞水平的拉曼技术平台可数秒内捕获大量生物信息；无损、原位非侵入性测量[9,10]。近年来，该技术在病原微生物检测领域开始崭露头角：如有学者对尿道感染患者尿液中和肺结核患者痰标本中病原体进行检测[11]。Montanari等[12]将单细胞拉曼技术与经典微生物检测技术结合，成功鉴定了288份血液透析用水中分离的146株酵母菌。然而，在口腔领域，相关致病菌的拉曼快速鉴别鲜有报道。

本实验分别采集口腔常见菌变异链球菌UA159、白色念珠菌ATCC10231和粪肠球菌ATCC29212三种菌株在对数期和稳定期两个不同生长时期的拉曼图谱，采用多元统计分析方法达到快速鉴别口腔致病菌的目的，分析口腔微生物拉曼图谱在不同生长时期的差异，以期开拓单细胞拉曼技术在口腔微生物领域的应用。

1、材料与方法

1.1 细菌菌株

变异链球菌UA159(S.m)、白色念珠菌ATCC10231(C.a)、粪肠球菌ATCC29212(E.f)(中科院青能所单细胞中心)。

1.2 材料和仪器

BHI培养液或培养基(Difco,USA);96孔板(Corning,USA);培养管(Corning,USA);培养皿(Corning,USA);厌氧袋(MGC,Japan);CO2培养箱(ThermoScientific,USA);超净工作台(ThermoScientific,USA);CaF2玻片(Crystranlimited,UK);单细胞拉曼分选仪(中科院青能所单细胞中心);电热恒温培养箱(Shelab,USA);离心机(Heraeus,Germany);Vortex振荡器(Scientificindustries,USA);超纯水器(Millipore,USA);高温高压灭菌锅(SANYO,Japan)。

1.3 培养液及试剂配制

BHI培养液：称取BHI粉3.7g,溶于100mL双蒸水，121℃高温高压灭菌15min,室温冷却后4℃冰箱保存。

1.4 实验方法

1.4.1 菌株生长周期观测

选取3种实验菌株进行BHI平板划线，37℃厌氧培养约24h。分别挑取单克隆菌落转接入5～10mL的BHI液体培养基中，厌氧培养，过夜活化。调整细菌浓度，按照5×105CFU/mL浓度转接到20mLBHI培养基中，厌氧培养。设定观测时间点为0、3、6、9、12、15、18、21和24h,在每个观测时间点分别提取待检测菌液200μL加入96孔板，酶标仪测定波长600nm的A值并予以记录。该实验进行3个生物学平行，重复3次。

1.4.2 菌株不同生长时期拉曼观测

BHI培养液活化菌株，设定拉曼观测时间点：变异链球菌(9h和15h)、白色念珠菌(10h和18h)、粪肠球菌(4.5h和9h)。在每个观测时间点分别取待检测菌液500μL,离心(2500×g)3min后弃上清，用同体积ddH2O重悬细菌沉淀，并做相应稀释使细胞终浓度达到106/mL。取1.5μL稀释液点在CaF2玻片上，风干。在拉曼显微镜下观察风干样品，将激光点定位到待测细胞，进行拉曼图谱采集。激光波长为532nm,样品上激光强度约为10mW,拉曼图谱采集时间为4～10s。每个菌种设有3个生物学平行，每个平行在每个时间点采集大约50个图谱。用LabSpec5软件进行拉曼图谱的背景去除、基准线归一化和最大值标准化处理。

采取主成分分析的分析方法对不同种类的口腔微生物以及不同生长时期的菌株进行分类；应用随机森林模型算法，计算出与物种类别差异高度相关的拉曼峰并且对其按贡献值进行排序，随后将有明确生物学归属的拉曼峰进行解析。

2、结果

2.1 生长状态观测

测量菌株生长曲线并确定生长周期。如图1所示，变异链球菌、白色念珠菌及粪肠球菌的对数生长期分别为9、10、4.5h,稳定期分别为15、18、9h。

2.2 菌株不同生长时期拉曼检测

分别选取对数期和稳定期的两个时间点进行拉曼检测。拉曼显微镜下正常细胞形态如图2所示，可以发现同一菌株在不同时期细胞形态无明显差异。进一步测量了不同菌株对数期与稳定期拉曼图谱，如图3所示，变异链球菌对数期与稳定期的拉曼图谱形态有明显差异；白色念珠菌的对数及稳定期光谱形态相似；粪肠球菌的对数及稳定期光谱形态相似。

2.3 不同生长时期谱峰差异分析

采用主成分分析分别针对3种菌株不同生长时期的拉曼图谱进行验证分析，分别如图4所示。结果表明变异链球菌、白色念珠菌和粪肠球菌的对数期和稳定期拉曼图谱均形成两个差异明显的群体并且能够彼此区分。

进一步对3种口腔菌在对数期和稳定期主成分分析中差异明显的单细胞拉曼图谱进行随机森林归类分析，结果如图5所示。变异链球菌、白色念珠菌和粪肠球菌在对数期和稳定期正确归类的准确率分别高达100.0%、99.86%和99.60%。

为深入了解不同时期拉曼光谱的差异性，本研究采用随机森林统计分析方法对所有拉曼峰的差异贡献值进行排序，并结合拉曼光谱确定了变异链球菌和粪肠球菌贡献值最大的两个拉曼峰分别为778～785cm-1和1431～1481cm-1,如图6所示，其生物学指代分别为778～785cm-1(DNAO-P-O键伸缩振动；胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶呼吸震动)[13];1431～1484cm-1(蛋白质C-D键震动、CH2键弯曲震动)[5,14],具体表现为随着生长周期的延长，表征核酸类物质的拉曼峰(778～785cm-1)和表征蛋白质的拉曼峰(1431～1484cm-1)下降。白色念珠菌贡献值最大的是1001～1007cm-1(苯丙氨酸)[13],同样出现下降。

2.4 不同菌株拉曼光谱鉴别

针对同一生长阶段(稳定期)的3种实验菌株进行PCA区分，如图7a所示，结果表明变异链球菌可以与另外两种口腔菌株(白色念珠菌和粪肠球菌)明显区分。对所有单细胞拉曼图谱进行随机森林归类定量分析，结果如图7b所示，3种菌株正确分类的准确率为99.68%。采用随机森林的统计分析方法将所有拉曼峰的差异贡献值进行排序，并结合拉曼光谱确定了贡献值最大的(1126～1128cm-1、736～744cm-1、1330～1440cm-1、778～785cm-1、1001～1003cm-1和1431～1481cm-1)6个拉曼峰，如图7c所示，其生物学指代分别为1126～1128cm-1(蛋白质)[15],736～744cm-1(胸腺嘧啶),1330～1440cm-1(脂质)[5],778～785cm-1(胞嘧啶、尿嘧啶)[13],1001～1007cm-1(苯丙氨酸)[12],1431～1481cm-1(蛋白质)[14],作为区分3种菌株的生物学标记。

3、讨论

临床上病原菌的快速鉴别是遏制感染及指导临床用药的前提与关键[16,17]。传统的鉴别均基于“培养法”,耗时长达24～48h,难以满足临床快检的需求。单细胞拉曼技术可快速识别细胞内核酸、蛋白质、碳水化合物、脂质和色素等信息，并结合多元统计分析方法有效实现菌种的快速准确区分[18]。目前基于单细胞拉曼技术的微生物鉴别已广泛应用于多个领域[19,20],但口腔微生物领域尚少。本文采用主成分分析与随机森林方法对三株口腔致病菌不同生长时期进行峰谱分析，发现单细胞拉曼光谱可以以较高的准确率区分菌株的生长时期和类别。

3.1 不同生长时期实验菌株拉曼光谱分析

本研究针对3种不同生长时期的实验菌株进行拉曼分类，以期能够通过不依赖培养的方法对不同生长时期的菌株细胞进行准确鉴别。PCA结果表明拉曼光谱可以准确区分同一菌株不同生长时期，使用随机森林模型进一步量化区分结果，三种菌株对数期与稳定期分类准确率分别高达100.0%(变异链球菌),99.86%(白色念珠菌)和99.86%(粪肠球菌)。继而对分类贡献值排序并结合单细胞拉曼图谱发现，在生长稳定期，变异链球菌与粪肠球菌表征胞内核酸物质的拉曼峰778～785cm-1和某些蛋白质的拉曼峰1431～1481cm-1较对数期降低。这可能是微生物在对数生长期时DNA复制活跃，而稳定期细胞大多数处于静止状态，DNA含量仅为对数期细胞的一半所致。由此推测某些特征性蛋白质含量下降与细菌细胞培养环境变化有关。白色念珠菌的苯丙氨酸(1001～1007cm-1)含量在对数期激增，表明苯丙氨酸是参与细胞繁殖的活跃化合物。

3.2 不同实验菌株拉曼光谱分析

基于全谱和多元统计分析方法的单细胞拉曼技术在微生物种类快速鉴别方面已取得显著成效。本文利用多元统计分析方法对3种口腔实验菌株进行分类鉴别。PCA聚类结果显示变异链球菌与另外两种口腔菌株(白色念珠菌和粪肠球菌)区分明显。实验进一步构建随机森林模型，其分类准确率高达99.68%。通过分析分类贡献值发现三种菌株拉曼光谱之间的差异主要集中于6个峰值(1126～1128cm-1、736～744cm-1、1330～1440cm-1、778～785cm-1、1001～1003cm-1和1431～1481cm-1),与之对应的拉曼标记物蛋白质、胸腺嘧啶、脂质、胞嘧啶、尿嘧啶、苯丙氨酸、蛋白质可以作为区分3种菌株的生物学标记。由此可见，虽然不同口腔微生物胞内基础物质结构和含量相似，但通过单细胞拉曼技术可以识别某些特征性物质，进一步推测不同口腔微生物细胞之间生理功能差异。

本文通过单细胞拉曼技术快速并准确的实现了在不同口腔微生物以及口腔微生物不同生长阶段的鉴别，这是首次在口腔致病菌中利用单细胞拉曼技术进行原位检测。拉曼光谱作为一种快速、准确、灵敏和简便的微生物表型表征方法，在细菌快速鉴定及快速检测中具有广阔应用前景。未来应探索更多的口腔感染微生物以建立全面的口腔数据库广泛应用于临床医疗。

参考文献:

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[8]李玲,杨丽玮.病原微生物检验中分子生物学技术的应用效果分析[J].临床检验杂志,2019,8(3):173.

文章来源：李姗姗,孙雁斐,郭艺,杨芳.基于单细胞拉曼技术的口腔病原微生物快速鉴别研究[J].口腔医学研究,2021,37(09):794-799.