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郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠骨折恢复的影响

2024-08-01 27 上传者：管理员

摘要：目的:探讨郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠骨折恢复的影响。方法:选取36只Wistar大鼠作为研究对象，按照处理方式不同分为空白组、模型组及实验组。模型组和实验组大鼠手术离断股骨干构建股骨骨不连大鼠模型，术后8周；实验组给予郑怀贤经验方(2.7 g/kg)外敷患肢，干预8周；模型组和空白组不做任何处理。观察并比较各组大鼠活动、毛发色泽变化和股骨干缺损、病理改变、血清学指标变化。结果:空白组大鼠活跃，食欲正常、被毛致密紧披有光泽色泽，股骨干骨质结构正常、软骨细胞排列有序；模型组大鼠活动状态减少、食欲降低、毛发稍燥、色泽较暗，且实验组大鼠上述情况有所改善；实验组大鼠干预4周时股骨缺损部位有骨痂，干预8周时骨缺损线消失、骨皮质连续，且与模型组大鼠相比，软骨细胞排列紊乱、结构缺少病理改变有改善，血清骨特异性碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OC)、I型原胶原N-端前肽(PINP)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)水平均高于模型组(P<0.05)。结论:郑怀贤经验方可提高成骨细胞活性、TGF-β、VEGF、BMP水平，促进股骨骨不连大鼠骨折恢复。

关键词：
成骨细胞活性
血管内皮细胞生长因子
转化生长因子β
郑怀贤经验方
骨不连
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骨不连是指骨折发生后超过正常骨折愈合时间仍未愈合的现象，呈现出疼痛、骨断端局部压痛等症状，使机体活动受限和负重降低，影响运动系统康复[1]。骨不连诱发因素众多，如骨折后骨折端固定不佳，骨折端异常活动、血液供给不足以及成骨环境不佳等，治疗前需循因辩证，开展针对性治疗[2]。骨不连在中医学中属于“骨痹”“骨痿”范畴，病机为本虚标实，外伤骨折淤血闭阻于内，筋脉失养、骨髓无以充填，中医治疗时需以消肿止痛、活血化瘀和续筋接骨为辩证以制定治疗方案。郑怀贤教授[3-4]为我国著名骨伤科专家，郑氏骨科是四川省非物质文化遗产代表性项目，已有近百年历史，具有独特的思想和医疗体系，郑氏伤科方药为郑怀贤教授的经验方(下文统称“郑怀贤经验方”)具有消肿止痛、疏松肌肉、温通经络以及疏风散寒等作用，促进骨折恢复效果良好。郑怀贤经验方由苏木、自然铜、骨碎补、羌活、独活和白及等15味中药组成，有活血、化瘀、续筋接骨功效，但其对骨不连作用机理鲜有报道。本研究拟探讨郑怀贤经验方对骨不连大鼠的潜在作用机理。

1、材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性Wistar大鼠36只，8～9周龄，体质量(300±30)g, 购于成都达硕实验动物有限公司，生产许可证号SCXK(川)2020-0030,饲养房温度为25～26 ℃,相对湿度为55%～60%,人工光照12 h/黑暗12 h, 饮食、饮水自由。

1.2 药物与试剂

郑怀贤经验方：苏木50 g、自然铜25 g、蟹粉25 g、骨碎补50 g、当归25 g、赤芍25 g、儿茶25 g、血余炭25 g、丁香15 g、木香25 g、没药25 g、羌活50 g、独活50 g、白及50 g、川芎25 g, 各味药物共研呈细末。骨特异性碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase, BALP)、骨钙素(osteocalcin, OC)、I型原胶原N-端前肽(type I procollagen N-terminal propeptide, PINP)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)测定试剂盒均购自上海烜雅生物科技有限公司。

1.3 动物建模、分组及干预

Wistar大鼠购回后适应性饲养1周，随机选取24只大鼠用于股骨骨不连模型建立，麻醉成功后，大鼠左侧股骨手术区域常规备皮、消毒并固定于平台，离断大鼠左侧股骨干(股外膜)[5],形成5 mm骨缺损，使用克氏针行骨髓腔固定，逐层缝合；术后每天肌肉注射8万单位青霉素防止感染，术后1次/d, 连续3 d, 术后将大鼠放回饲养笼自由饲养；手术后8周，使用X射线检测股骨干缺损情况，若骨折端表现出萎缩硬化、无骨痂形成则表示股骨骨不连模型制备成功，本研究骨不连制模过程中无大鼠死亡，均制模成功。将制模成功大鼠随机分为模型组、实验组两组，每组各12只；另选取12只大鼠为空白组，不做任何处理。术后8周，实验组大鼠患肢外敷郑怀贤经验方2.7 g/kg(药物剂量为成人与大鼠表面积折算系数6.25换算的等效剂量),1次/d, 12 h/次，用无菌纱布包裹、胶带固定以防止药物脱落。空白组、模型组不做处理。

1.4 大鼠一般情况观察

干预前及干预8周后，观察大鼠食欲、活动状态、毛发色泽等生理活动。

1.5 X射线检测大鼠股骨骨缺损情况

干预4、8周时，使用小动物超声系统观察大鼠左股骨干中部离断部位变化情况。

1.6 苏木精-伊红染色法(HE)观察大鼠股骨病理变化

干预8周时，取各组大鼠股骨干或骨折组织，分别使用多聚甲醛、乙二胺四乙酸对化骨组织进行固定、脱钙，常规石蜡包埋、切片、HE染色、封片、显微镜下观察病理变化。

1.7 大鼠血清成骨细胞因子和TGF-β、VEGF、BMP-2水平检测

于干预前及干预4、8周，抽取大鼠腹主动脉血3 mL,以3 000 r/min离心10 min, 收集上清液，使用酶联免疫吸附法检测血清BALP、OC、PINP、TGF-β、VEGF、BMP-2水平。

1.8 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料以

表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠外观和行为的影响

空白组大鼠活跃、食欲正常、被毛致密紧披有光泽色泽；干预8周，相比空白组，模型组大鼠活动状态明显减少、食欲降低，毛发稍燥、色泽较暗，实验组大鼠在饲养笼中较模型大鼠活跃、食欲增加且毛发柔顺度、色泽均优于模型组。

2.2 郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠骨愈合情况的影响

干预4周，模型组大鼠左侧股骨干缺损明显，试验组大鼠左侧股骨干缺损部位有明显骨痂；干预8周，模型组大鼠股骨干缺损部位仍可见骨缺损缝线，实验组大鼠的骨缺损线消失、骨皮质也连续。见图1。

图1 各组大鼠骨愈合情况

2.3 郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠病理变化的影响

干预8周时，空白组大鼠的股骨干骨质结构正常、软骨细胞排列有序，模型组大鼠软骨细胞出现核聚缩、软骨细胞坏死、骨小梁细胞减少，实验组大鼠软骨细胞排列紊乱和结构缺陷减缓。见图2。

2.4 郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠成骨细胞的影响

干预前，模型组大鼠血清BALP、OC、PINP均低于空白组(P<0.05),实验组大鼠血清BALP、OC、PINP与模型组大鼠比较差异无统计意义(P>0.05);干预4、8周时，模型组大鼠血清BALP、OC、PINP均低于空白组(P<0.05),但实验组大鼠血清BALP、OC、PINP均高于模型组(P<0.05)。见表1-表3。

2.5 郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠血清TGF-β、VEGF、BMP-2水平的影响

干预前，模型组大鼠血清TGF-β、VEGF、BMP-2水平均低于空白组(P<0.05),实验组大鼠血清TGF-β、VEGF、BMP-2与模型组大鼠差异无统计意义(P>0.05);干预4、8周，模型组大鼠血清TGF-β、VEGF、BMP-2均低于空白组(P<0.05),实验组大鼠血清TGF-β、VEGF、BMP-2均高于模型组(P<0.05)。见表4-表6。

图2 各组大鼠股骨病理变化（HE×200)

*P<0.05,与空白组比较；#P<0.05,与模型组比较。

表1各组大鼠血清BALP水平比较

表2各组大鼠血清OC水平比较

表3各组大鼠血清PINP水平比较

表4各组大鼠血清TGF-β水平比较

表5各组大鼠血清BMP-2水平比较

表6各组大鼠血清VEGF水平比较

3、讨论

中医学对骨不连病因、病机认知发现骨不连与肝肾不足、血瘀、气血亏虚等关系密切，骨不连的标在筋骨、本在肝肾[6]。清代医学名家陈士铎提出血瘀不去、骨不生的观点，认为骨折愈合过程为瘀去、新生、骨合，肢体损伤在外，气血损伤在内，骨折久致正气耗伤，易出现气血两虚，筋骨失濡养，最终导致骨不连。本研究显示，经郑怀贤经验方治疗后，股骨骨不连大鼠的活动状态增加、食欲增加且毛发、色泽均得到明显改善，外敷治疗4周大鼠股骨干缺损部位有明显骨痂，持续治疗至第8周，大鼠股骨缺损部位消失，骨皮质连续，股骨干软骨细胞排列紊乱及结构缺损情况得到明显改善，说明郑怀贤经验方能促进股骨骨不连大鼠骨折处愈合。郑怀贤经验方中的苏木可行血祛瘀、消肿止痛，骨碎补活血续伤，自然铜散瘀、接骨止痛，蟹粉补骨添髓、养筋活血，当归、赤芍、血余炭活血祛瘀，儿茶收湿敛疮、生肌止血、活血止痛，丁香、木香、没药和川芎活血、行气、止痛，羌活、独活散寒、祛风、除湿，白及消肿、生肌；诸药合用有活血、祛瘀、止痛和续接筋骨功效，促进骨不连骨折恢复。

正常骨折愈合需经过肿胀、血肿机化、原始骨痂、骨痂改造和塑形阶段，受到多种因子共同调节，成骨细胞在该过程中发挥重要作用，可促进骨痂形成，骨折损伤可引起骨折端骨组织血供减少，恶化骨折愈合环境[7-8]。BALP、OC和PINP均由成骨细胞合成分泌，BALP通过水解磷酸酶供给磷酸促进羟基磷灰石沉积、成骨形成[9];血OC含量增加可增强成骨细胞活性，是骨基质矿化的必需物质[10],可抑制破骨细胞活性[11];PINP是骨组织有机质的主要成分，血液系统中PINP含量升高反映成骨细胞合成骨胶原能力增强[12]。本研究显示郑怀贤经验方干预后，实验组股骨骨不连大鼠血清BALP、OC、PINP水平高于模型组，与王军威等[13]研究结果相似，说明郑怀贤经验方可促进股骨骨不连大鼠骨愈合，这可能与成骨细胞活性增加有关。

骨折愈合过程中，VEGF作为主要血管调节因子，可促进血管重建、修复，为骨痂提供充足血液供给和良好的营养环境[14-15]。TGF-β参与创伤愈合、组织纤维化和成骨生成过程，促进刺激I型胶原合成、膜内成骨及软骨细胞合成、骨痂形成[16-17]。BMP-2是骨形态发生蛋白家族成员，可调节骨祖细胞增殖、分化，诱导未分化间充质细胞分化为成骨细胞，促使新骨形成[18-19]。本研究中，郑怀贤经验方干预后，实验组股骨骨不连大鼠血清TGF-β、VEGF、BMP-2水平均高于模型组，与既往研究[20-21]结果相似，说明郑怀贤经验方能通过提高TGF-β、VEGF、BMP-2水平促进成骨形成、股骨骨不连骨愈合。

综上，郑怀贤经验方可促进股骨骨不连大鼠骨折恢复，其作用机制可能与促进成骨细胞活性以及提高TGF-β、VEGF、BMP水平有关。

参考文献:

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基金资助:四川省中医药管理局科学技术研究专项(2021MS245);

文章来源:魏林,檀亚军,孙玉,等.郑怀贤经验方对股骨骨不连大鼠骨折恢复的影响[J].川北医学院学报,2024,39(08):1018-1021+1035.