骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种临床常见的骨骼疾病，多发于女性及老年人。其主要特点是骨组织质量与密度下降，骨骼脆弱、易碎以及骨骼强度和抗压能力大幅度下降[1]。根据世界卫生组织数据显示，全球已有超2亿人患有OP病症[2]。年龄、生活习惯、遗传因素、雌激素水平变化等均可在一定程度上导致OP的发生[3]。其中，成骨细胞是在骨骼中起关键作用的细胞，它们参与了新骨组织的形成和修复。在OP中，由于成骨细胞功能受到损害，导致合成新骨基质的能力明显下降，使骨骼极易受损[4-5]。针刺作为一种传统中医疗法，对临床多种骨类疾病的治疗均具有独特的疗效，在过程中可通过调节机体气血运行和促进血液循环的方式来改善疾病症状[6]。外敷温经药酒则为一种中医传统疗法，通过将中草药熬制成药酒外敷、涂抹或浸泡于患处，起到温经活血、减轻疼痛、改善局部血液循环及促进新陈代谢等作用[7]。由此，本研究通过探究外敷温经药酒联合针刺在OP中的治疗作用，意在为日后相关疾病的治疗提供一定研究基础。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验大鼠：

选取SPF级雌性大鼠40只，月龄4～6月，体质量280 ～ 300 g, 购自北京生物制品研究所动物实验中心，许可证号：SCXK(京)2021-0009。在温度22 ℃ ～ 24 ℃,湿度40 % ～60 %、明暗交替环境下自由饮食饮水。本研究经河北省中医院动物伦理委员会批准(HNZYY-2019007),操作均符合《实验动物管理条例》规定。

1.1.2 仪器与试剂：

电针仪(南京济生医疗科技有限公司，HANS-200A);一次性无菌针(河南泽垣医疗器械销售有限公司，0.35 mm×50 mm);兔抗Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2抗体(上海雅吉生物科技有限公司，货号YS-12625R、YS-2378R、YS-23034R、s-4244R);山羊抗兔IgG(上海羽哚生物科技有限公司，货号YLY1079);ELISA检测试剂盒(武汉云克隆科技股份有限公司，货号SEA902Ra、SEA108Ra、CEA957Ra);双能X线骨密度仪(上海聚慕医疗器械有限公司，型号：EXA-3000);全自动生化分析仪(山东高芯生物传感器研究院有限公司，货号BK-1200);HE 染色试剂盒(上海吉至生化科技有限公司，货号AG1120);TUNEL试剂盒(武汉纯度生物科技有限公司，货号CD-100605GM)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与模型建立：

将40只大鼠分为正常组、模型组、针刺组、联合组，每组10只。除正常组外其余均建立OP大鼠模型。手术前禁饮食6 h, 用10 %戊巴比妥钠3 mL/kg 进行腹腔麻醉，无菌条件下经背部进入切除双侧卵巢后立即缝合伤口。术后待大鼠自然清醒后为避免感染使用青霉素(4×104U/只)干预3 d。建模12周后，随机抽取大鼠分离股骨观察病理切片，显示有骨质疏松病理改变为建模良好。本次实验均造模成功，无动物脱失及死亡现象。

1.2.2 给药方法：

正常组、模型组不予处理。针刺组采用针刺治疗，将针刺部位暴露并消毒后依据文献[8]取穴，将针刺入穴关元、三阴交(双)、肾俞(双)、后三里(双)后连接电针仪，调节强度2 mA,频率2 Hz/15 Hz, 5 d/周，1次/d, 20 min/次，共12周。联合组在针刺治疗基础上采用温经药酒(制川乌、制草乌、蜈蚣、乌梢蛇、红花、川芎、自然铜、地龙，均购自北京同仁堂)外敷干预，取无菌纱布块将其浸泡于饮用酒(乙醇含量≥ 50 %)中密封，外敷膝关节位置，2次/d, 按摩10 min/次，连续治疗12周。

1.2.3 检测方法

1.2.3.1 ELISA检测：

给药结束后24 h, 将各组大鼠进行麻醉后打开腹腔，腹主动脉取血5 mL,室温静置30 min后，3 000 r/min离心15 min, 取上清，- 20 ℃保存。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测骨钙素(osteocalcin, OC) 、吡啶酚(pyridine phenol, PYD)、Ⅰ型前胶原羧基端肽(procollagen typeⅠcarboxy terminal peptide, PICP)水平。

1.2.3.2 计算机断层扫描检测：

用10 %戊巴比妥钠(40 mg/kg)将大鼠麻醉处死后，取右侧股骨组织，固定在70 %乙醇中，使用Scanco μCT-35 仪器对骨体积结构进行检测，采用Scanco软件对骨小梁厚度(average trabecular thickness, Tb.Th)、骨小梁间隔(trabecular separation, Tb.Sp)、骨密度(bone mineral density, BMD)、皮质骨面积百分数(Ct. Ar)等进行检测，分析直接位于骨近端生长板远端的小梁区域。

1.2.3.3 TUNEL检测成骨细胞凋亡：

取股骨组织进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡后，将切片置于3 %过氧化氢中浸泡10 min, PBS洗涤3次，加入蛋白酶K后进行室温孵育10 min, 洗涤。以TUNEL分析试剂盒对凋亡的DNA片段进行异硫氰酸荧光素末端标记，37 ℃温育30 min, 洗涤，染色，抗荧光衰减封片剂封片。在荧光显微镜下观察，绿色荧光颗粒为凋亡细胞，随机选择5个视野观察，凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100 %。

1.2.3.4 HE染色观察股骨组织病理变化情况：

将股骨组织固定于10 %中性甲醛中，脱钙，石蜡包埋，制备5 μm切片。苏木素染色5 min, 清洗，1%盐酸乙醇分化，清洗，伊红染色3 min, 清洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，干燥，中性树胶封片后于显微镜下拍摄观察骨小梁结构是否出现减少、疏松、变细、断裂。评分标准： 0分： HE染色结果正常；1 分： HE 染色结果仅在极少数视野内出见轻微病变情况；2 分： HE 染色结果出现轻度病变情况且视野范围小于 25 %;3 分： HE 染色结果出现中度病变情况且视野范围小于 50 % ;4分： HE 染色结果出现重度病变情况且视野范围大于75 % ; 如观察结果在0～1分，计0.5分，以此类推。

1.2.3.5 Western blot 法检测：

取股骨组织，加入RIPA 蛋白裂解液提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒定量分析后电泳并转至PVDF膜，以5 %脱脂奶粉封闭2 h, 加一抗Notch 1(1∶1 000)、Notch 2(1∶1 000)、Jagged 1(1∶500)、Jagged 2(1∶500)、β-actin(1∶1 000),4 ℃下孵育过夜，洗膜后加二抗(1∶5 000),室温孵育2 h, 加ECL试剂显影，采用Image J软件分析蛋白灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料采用

表示，多组间比较用双因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠股骨组织μCT检测结果比较

与正常组比较，模型组大鼠股骨组织Tb.Th、BMD、Ct. Ar降低、Tb.Sp升高(P<0.05);与模型组比较，针刺组大鼠Tb.Th、BMD、Ct. Ar升高、Tb.Sp降低(P<0.05);与针刺组比较，联合组大鼠Tb.Th、BMD、Ct. Ar升高、Tb.Sp降低(P<0.05),见表1、图1。

表1各组大鼠股骨组织μCT检测结果比较

图1各组大鼠股骨组织μCT检测结果比较

2.2 各组大鼠血清中OC、PYD、PICP表达

与正常组比较，模型组大鼠血清中PYD升高，OC、PICP降低(P<0.05);与模型组比较，针刺组大鼠血清中PYD降低，OC、PICP升高(P<0.05);与针刺组比较，联合组大鼠血清中PYD降低，OC、PICP升高(P<0.05),见表2。

2.3 各组大鼠成骨细胞凋亡比较

与正常组比较，模型组成骨细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与模型组比较，针刺组成骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05);与针刺组比较，联合组成骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05),见表3、图2。

表2各组大鼠血清中PYD、OC、PICP表达

表5Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2蛋白比较

表3各组大鼠成骨细胞凋亡比较

图2TUNEL检测成骨细胞凋亡(×400)

2.4 各组股骨组织病理变化对比

正常组骨松质部位骨小梁饱满均匀，形态结构完整性、连续性均良好，排列规则，腔内骨髓细胞数量丰富；模型组骨小梁明显减少，排列稀疏、紊乱，有严重断裂现象，并含有大量骨小梁盲端，骨髓腔内造血细胞大量减少；针刺组骨形态结构有所改善，但排列仍不规则并伴随部分断裂；联合组骨形态结构排列趋于规则，连续性与完整性均显著改善，见表4、图3。

表4各组大鼠股骨骨小梁病理评分

图3各组股骨组织病理变化对比(400×)

2.5 各组Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2蛋白比较

与正常组比较，模型组大鼠股骨组织中Notch1、Notch 2、Jagged1、Jagged 2蛋白表达均降低(P<0.05);与模型组比较，针刺组Notch 1、Notch 2、Jagged1、Jagged 2升高(P<0.05);与针刺组比较，联合组Notch1、Notch 2、Jagged1、Jagged 2升高(P<0.05),见表5、图4。

图4各组Notch1、Notch 2、Jagged1、Jagged2蛋白比较

3、讨论

随着年龄的增长和骨骼更新速度的减慢，使得骨骼的质量、密度逐渐下降，极易发生OP。女性在更年期时，由于卵巢功能的减退以及雌激素水平异常导致OP的发生率明显增加。

胶原是骨骼组织中主要结构蛋白质之一，PICP是骨细胞合成胶原蛋白的一部分，对维持骨稳定性至关重要[9]。OC是一种由骨细胞合成的蛋白质，PYD则是骨骼中一个特定成分，OP导致的骨细胞功能异常可影响OC的合成和分泌，并导致骨吸收增加进而释放大量PYD,最终加快疾病进程[10]。本研究在建模12周后，随机抽取建模大鼠分离其股骨组织并观察病理切片，显示具有明显骨质疏松病理改变，且模型组大鼠血清中的PYD水平较高，OC、PICP较低，经干预后均有所改善，其中以联合组PYD降低和OC、PICP升高的最为显著。提示外敷温经药酒联合针刺对于改善OP时期的骨代谢水平效果良好。中医认为，针刺可通过刺激穴位和周围皮肤促进局部血液循环，并提高氧气和营养物质的供应并改善疾病[11]。在人体特定穴位施加针刺刺激，可在调节局部穴位和皮肤的气血运行的同时，起到促进骨细胞生长和新陈代谢的作用[12]。温经药酒中的益母草、川芎、当归等均是传统中药中常用的温经药物，常被认为具有活血化瘀、温通经络等作用[13]。二者联合，可通过神经内分泌系统和免疫系统等途径对骨代谢水平进行调控，并在改善局部血液循环的同时使骨骼的吸收和生成平衡得到稳定，有助于改善PYD、OC、PICP水平并提高临床治疗效果。有研究表明，针刺联合中药干预对于改善OP时期的骨代谢水平作用良好[14]。

OP的主要特征是骨质减少、骨微结构破坏以及骨小梁厚度损坏、骨小梁厚度降低，同时引发骨骼的结构强度和稳定性明显下降，骨小梁之间的间隔增大、骨质明显减少，最终导致骨骼结构的疏松程度不断加大使得疾病进展加剧[15]。本研究结果显示，OP大鼠的Tb.Th较低、Tb.Sp较高，经干预后均有所改善，其中以联合组Tb.Th升高和Tb.Sp降低的作为明显，提示外敷温经药酒联合针刺对于改善OP时期的骨体积结构具有积极作用。针刺作为传统的中医治疗方法，可通过在特定穴位入针以起到调整生理功能和平衡能量的作用。药物经外敷干预后可在促进血液循环、减少炎症反应的同时增加骨细胞活性和改善骨小梁形成。而二者联合应用通过发挥协同作用，可在促进血液循环和改善组织代谢的过程中使骨骼的吸收和生成平衡得到有效恢复，最终起到提高骨骼强度和改善骨骼健康的目的。有研究表明，针灸结合中药外敷对OP性骨折的临床治疗效果良好[16]。

成骨细胞常工作于骨转化过程中，可通过产生新的骨组织来维持的骨骼健康稳态。然而，在OP发生时由于骨骼破坏加速，常导致成骨细胞数量大幅度减少，新骨生成的速度无法跟上骨骼的破坏速度，这也导致了骨质量的下降[17]。OP的主要特征是骨密度降低和骨质破坏，成骨细胞和破骨细胞之间的平衡是保持骨骼健康的重要机制。在OP中由于骨平衡被破坏使得破骨细胞活性明显增加，成骨细胞活性明显减少，这也造成了骨骼损伤的进一步加剧。良好的血液循环有助于骨细胞的正常代谢和功能修复。Notch信号通路通过调节一系列基因的表达调控成骨细胞的生理功能，通过Notch受体和配体之间的相互作用不仅可激活Notch信号通路还可在细胞内传递信号，参与细胞调控。文中结果显示，OP大鼠成骨细胞的凋亡率较高，经干预后细胞凋亡程度均有所降低，其中以联合组降低的最为显著。提示外敷温经药酒联合针刺对于抑制OP时期的成骨细胞凋亡具有一定积极作用。传统温经药物被认为具有活血化瘀、温通经络等药理作用，且通过活性成分调节骨细胞功能具有促进成骨细胞增殖、加速骨基质生成、增加骨密度等作用[19]。且有相关研究表明，温热药物具有促进成骨细胞活性和骨形成的作用[18]。联合针刺治疗后，可在刺激神经系统的同时，有效稳定了成骨细胞与破骨细胞间的代谢平衡，增加了成骨细胞的增殖、分化活性，加速了骨基质的分泌与合成，最终起到缓解OP症状及促进骨骼健康恢复的目的。Notch作为一条重要的细胞信号通路，可参与调控成骨细胞的增殖、分化，并具有促进新骨形成，调控骨骼发育和骨代谢等作用。Jagged1和Jagged 2则是Notch信号途径中的配体，它们可与Notch受体结合并激活Notch信号传导[20]。OP不仅可导致骨细胞之间的通讯紊乱，还会造成Notch等相关信号通路受到干扰，进而导致成骨细胞功能受损和新骨形成减少并进一步加剧骨骼的失衡。文中结果显示，OP大鼠的Notch1、Notch 2、Jagged1、Jagged 2均较低，经干预后均有所升高，其中以联合治疗组升高的最为显著，提示外敷温经药酒联合针刺对于改善OP时期的Notch1、Notch 2、Jagged1、Jagged 2异常表达可能具有一定作用。分析外敷温经药酒与针刺联合应用发挥作用的原因可能为，在活化Notch1及相关信号通路的过程中平衡了成骨和骨骼的吸收过程，抑制了骨骼中炎症因子和降解酶的产生，改善了骨骼细胞的吸收活动，最终起到促进骨形成、减少骨吸收、降低骨量丢失和维持骨骼平衡状态的目的。且有研究表示，针刺对膝骨关节炎等疾病的治疗作用良好，其机制可能与调节受体Notch1、Notch 2,以及配体Jagged1、Jagged 2等蛋白表达来实现的[21]。但在针刺基础上联合外敷温经药酒可更好的发挥协同作用，改善疾病。

综上所述，外敷温经药酒联合针刺在OP治疗中对于调节骨代谢指标、抑制成骨细胞凋亡、改善骨稳态等方面均具有良好效果，具有一定的潜力。但对于其在Notch等相关信号通路调节中的具体作用机制还需后续进一步探究。当然本研究也存在一定的不足之处，如未设置外敷温经药酒组，因此对于联合的优势及发挥的疗效并不明确。同时，由于PYD的改变对破骨细胞产生的影响仍需要进一步验证，但本研究未进行细胞实验，因此对于Notch相关信号通路的改变机制还需进一步探究，后续会采用免疫荧光共定位反应方法对成骨细胞的信号变化进一步验证。

参考文献:

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基金资助:河北省中医药管理局科研计划项目(2023031);

文章来源:温志刚,马欣,路帅,等.外敷温经药酒联合针刺对骨质疏松大鼠的影响[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(09):1305-1310.