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COL2在绝经后女性中的表达与骨质疏松相关性的研究

2021-09-16 172 上传者：管理员

摘要：目的探讨Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ,COL2)表达水平与骨质疏松之间的相关性。方法收集2017年1月至2019年12月在新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心关节老年病区行手术治疗的髋部骨折60例患者,按照双能X线骨密度(DXA)检测分为骨量正常、骨量减少、骨质疏松和严重骨质疏松4组,每组15例,分别于术中取患者股外侧肌肉组织行RT-PCR及免疫组化检测COL2mRNA及蛋白表达水平的差异性,并综合分析COL2表达水平与骨质疏松的相关性。结果RT-PCR及免疫组化检测结果显示,骨量正常组COL2mRNA及蛋白表达水平与骨量较少组之间差异无统计学意义(P>0.05);骨量减少组COL2mRNA及蛋白表达水平明显高于骨质疏松组,且差异有统计学意义(P<0.05);骨质疏松组COL2mRNA及蛋白表达水平明显高于严重骨质疏松组,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论COL2表达水平与骨质疏松呈负相关,COL2可能是预防绝经后女性骨质疏松性髋部骨折的治疗靶点。

关键词：
Ⅱ型胶原蛋白
肌肉减少症
骨密度
骨质疏松症
髋部骨折
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骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性骨骼疾病，其特点是骨质密度降低、骨质脆性增大、骨组织结构退化致骨量减少和容易骨折[1,2]。引起骨质疏松症的因素有多种，例如雌激素缺乏、年龄及遗传因素等[3]。世界卫生组织(WHO)公布有关骨质疏松症的数据显示，OP影响了美国、欧洲、日本和中国约7500万人[4]。绝经后女性是易患骨质疏松症的高危人群，其重要原因就是雌激素缺乏[5]。骨质疏松又大大增加髋部骨折的发生率，进而降低患者的生活质量，增加致残率，甚至增加死亡率。

胶原蛋白是人体细胞外间质的主要成分之一，是人体蛋白质大家族成员，目前一共有14种类型，共两大类:纤维性胶原和非纤维性胶原，分布特点及功能各不相同。目前研究表明，Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ，COL2)主要是软骨细胞分泌合成，大多数见于骨骼、关节、肌腱等组织，Ⅱ型胶原蛋白是正常软骨细胞分泌的主要胶原蛋白，Ⅰ型胶原蛋白非常罕见[6]，骨性关节炎病程中的重要环节是Ⅱ型胶原蛋白形成的网状结构遭到破坏[7,8]，进而引起软骨生物力学、生物化学等一系列变化[9,10,11]。相关研究[12]表明，肌肉减少症的主要特征就是II型肌纤维和运动神经元的数量减少，严重影响了肌肉强度及身体平衡能力。因此，肌肉减少症患者具有较高的跌倒风险性，特别是骨量减少及骨质疏松的患者，这是发生髋部骨折的重要原因。但至今有关Ⅱ型胶原蛋白与骨质疏松的相关性未见报道，本研究通过骨量正常、骨量减少、骨质疏松和严重骨质疏松4组患者骨骼肌中Ⅱ型胶原蛋白表达的差异性，探讨Ⅱ型胶原蛋白与骨质疏松之间的相关性。

1、材料和方法

1.1入选对象

选取自2017年1月至2019年12月在新疆维吾尔自治区人民医院骨科中心关节老年病区就诊的绝经后女性髋部骨折患者共60例，平均年龄(64.5±11.4)(48～89)岁，按照双能X线骨密度(DXA)检测分为骨量正常、骨量减少、骨质疏松和严重骨质疏松4组，每组各15例。

1.2纳入、排除标准

纳入标准:(1)绝经后女性;(2)髋部骨折;(3)行手术治疗(人工全髋关节置换术或内固定术“动力髋钢板内固定术”(DHS)或闭合复位髓内钉固定术(PFNA);(4)患者自愿参加、知情同意，并签署知情同意书。

排除标准:(1)吸烟、饮酒者;(2)近3个月服用影响骨代谢的药物(如糖皮质激素)者;(3)患有影响骨骼肌肉代谢的疾病(如糖尿病、肿瘤、甲状旁腺功能亢进、类风湿关节炎等)者;(4)合并有严重疾病(如冠心病、慢性阻塞性肺疾病、肺心病、肝肾功能不全、血液病)者;(5)患有其他骨骼肌肉疾病者。

1.3方法设计

术前行双能量X线骨密度(DXA)检测，分为骨量正常、骨量减少、骨质疏松和严重骨质疏松4组，术中取患者相同部位的股外侧肌肉组织，放入-80℃存放待测，然后行RT-PCR及免疫组化检测COL2的mRNA及蛋白的表达水平，并对结果行统计学分析。

1.4实验方法

标本制作:术中取患者相同部位的无损伤的股外侧肌肉组织两份，一份肌肉组织切成3mm×3mm×3mm，置于-80℃存放，用于RT-PCR检测;另一份肌肉组织切成5mm×5mm×5mm，多聚甲醛固定，石蜡包藏，用于免疫组化检测。

RT-PCR检测mRNA:(1)Trizol法提取RNA，取微量分光光度计对溶解后的RNA2μL进行测定OD260、OD280和OD260/OD280值，并且根据结果计算出RNA的纯度和浓度。

(2)反转录成cDNA，按照表1进行反转录。(3)RT-PCR检测，按照表2、3进行RT-PCR检测。

反应条件:25℃5min,50℃15min,85℃5min,4℃10min。

反应条件:50℃2min,95℃10min;95℃30sec,60℃30sec,40个循环。

免疫组化(IHC)检测:用65℃恒温箱对组织切片进行烘烤1.5～2h;取新鲜组织切片，分两次放入二甲苯中各浸泡10min;放入无水酒精静止5min，再置于95%、90%、80%、70%乙醇、蒸馏水各静放5min;把0.01mol/L枸橼酸缓冲液(pH6.0)放入高压锅中煮沸，然后把切片放入修复液中，一直加热到排气，断火，在缓冲液中浸泡10min，然后冷却;去除内源性过氧化物酶;用PBS浸泡不锈钢提篮;按照合适比例对一抗进行稀释(表4)，然后在每张片子里加入稀释后的一抗50μL，放在4℃环境中过夜(第二天需室温复温20min);将辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗50μL放入，在室温中静放20min;再把不锈钢提篮放在PBS里浸泡;加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液50μL，放在室温中孵育20min;再次把不锈钢提篮放在PBS里浸泡;用DAB进行显色3～10min，利用显微镜观察染色程度(DAB显色为棕色颗粒状沉淀)，并记录;放在自来水里将显色终止3min;苏木精复染3min，盐酸酒精分化数秒(1～2s);自来水中反蓝5min;分别在蒸馏水、70%、80%、90%、95%乙醇中浸泡3min，再在无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，分别浸泡5min;在二甲苯Ⅰ、Ⅱ，分别浸泡5min;中性树胶封片;37℃烤片过夜。

1.5统计学处理

实验数据以表示。采用SPSS24.0软件进行统计分析。采用t检验和单因素方差分析方法评估组间差异。对4组患者的COL2的mRNA及蛋白表达水平等指标进行t检验;并进行Pearson相关性分析对骨质疏松症的影响，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1RT-PCR检测COL2mRNA结果

RT-PCR检测COL2mRNA结果显示，由图1可知COL2mRNA在骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组和严重骨质疏松组4组中的表达量呈逐渐减少趋势，骨量正常组中COL2mRNA的表达水平与骨量减少组之间的差异无统计学意义(P>0.05);COL2mRNA在骨量减少组的表达水平明显高于骨质疏松组，且差异有统计学意义(P<0.05);骨质疏松组中的COL2mRNA的表达水平明显高于严重骨质疏松组，且差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2免疫组化(IHC)检测COL2蛋白表达

免疫组化检测COL2蛋白的表达结果显示，COL2蛋白表达情况被染为棕褐色，由图2可知，棕褐色颗粒数目在骨量正常组、骨量减少组、骨质疏松组和严重骨质疏松组4组中的表达量呈逐渐减少趋势，在骨量正常组和骨量减少组的表达情况差异无统计学意义;COL2蛋白在骨量减少组的表达明显强于骨质疏松组，而在骨质疏松组的表达明显强于严重骨质疏松组。

3、讨论

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是一种全身性骨骼疾病，使骨质密度降低、骨强度下降、骨质脆弱，从而容易发生骨折[13]。在解剖位置上，肌肉与骨骼相互毗邻，它们的旁分泌和内分泌调节拥有着共同通路，分子信号调节通路相似，并且有着相似的治疗靶点及药物[14]。肌肉纤维减少和骨质疏松共同作用影响患者身体的平衡，使患者容易发生跌倒，增加脆性骨折的概率，大大降低患者的生活质量，尤其是绝经后女性。众所周知，绝经后女性发生骨质疏松的概率会明显上升，进而绝经后女性是发生髋部骨折的高危人群。随着人口老龄化逐年发展，有专家预计骨质疏松性髋部骨折的发生会在2050年呈指数级增长[15]。相关研究预测，到2050年，髋部骨折的数量将从2018年的1124060例增加到2563488例[16]。肌肉与骨骼不同之处在于，人的年龄在25岁前机体的肌肉量就已达到顶峰时期，随着年龄增长，肌纤维数量也在逐年减少，其中肌肉质量的下降程度明显低于肌肉强度和肌肉力量的下降程度[17]。肌肉减少症很早以前就被人提出过，所谓肌肉减少症也称为肌少症(Sarcopenia)，是指与年龄相关的全身肌量减少和/或肌肉强度下降或肌肉生理功能减退，导致身体平衡能力及活动程度明显下降的一种退行性疾病[18]。肌肉减少症与骨质疏松症是导致绝经后女性患者发生髋部骨折的两大重要因素，大大降低了绝经后女性的生活质量，增加了死亡率。

髋部骨折对患者身心健康产生严重有害影响，在经济和精神方面，对患者家庭带来巨大负担，对患者本人造成重大心理创伤，对社会产生较大的负面影响。肌肉减少症主要是Ⅱ型肌肉纤维的减少，并伴有运动神经元数量减少，导致肌肉含量及功能受到严重的有害影响，进而引起步速减慢、身体摇摆性增加，最终造成人体平衡能力大大减弱，增加了跌倒的风险，而跌倒往往又是髋部骨折的直接诱因[19,20]。为预防髋部骨折的发生，降低其发生率，必须找到干预的靶点。现有文献报道，Ⅱ型胶原蛋白生成主要由软骨细胞分泌，而软骨细胞普遍存在于肌腱、关节、骨骼等组织，至今未见文献报道Ⅱ型胶原蛋白在骨骼肌中表达水平与骨质疏松之间的相关性。

本研究选取绝经后发生髋部骨折的女性患者60例，并且都行手术治疗，术中同一个术者取相同部位的无损伤的股外侧肌肉组织，RT-PCR结果显示在骨量正常和骨量减少两组中COL2mRNA的表达水平差异无统计学意义(P>0.05);然而在骨量减少组中COL2mRNA的表达水平明显高于骨质疏松组(P<0.05);严重骨质疏松组中的COL2mRNA的表达水平明显低于骨质疏松组(P<0.05)。免疫组化(IHC)检测结果显示，COL2蛋白的表达在骨量正常和骨量减少两组差异无统计学意义(P>0.05),COL2蛋白在骨质疏松组中的表达明显弱于骨量减少组(P<0.05)，而在严重骨质疏松组中的表达明显弱于骨质疏松组(P<0.05)。两个实验结果可得出，COL2是与骨质疏松呈负相关性的，COL2又是肌肉减少症的主要影响因素，COL2是与骨质疏松及肌肉减少症相关的因素，然而骨质疏松和肌肉减少症共同影响着绝经后女性的身体的平衡能力，导致患者易跌倒，进而增加髋部骨折的发生机率，大大降低患者的生活质量[21,22]。

Binkley等[23]根据对肌肉和骨骼的研究，以及结合对肌少症和骨质疏松症的了解，提出了“肌少-骨质疏松症”的概念，主要是指临床确诊为骨质疏松症的患者同时伴有肌肉质量和/或功能的下降。结合我国的国情[24,25]，建议相关评估标准如下:(1)DXA评估骨量和肌肉量;(2)测试步速，以0.8m/s为临界值;(3)在静息情况下评估优势手握力(AWGS推荐的标准)。依据DXA结果，若肌肉量<-2SD(参照青年健康人峰值)可诊断为肌量减少，骨量<-2.5SD(健康人峰值)可诊断为骨质疏松症，同时满足“肌少症”和“骨质疏松症”的患者，诊断可以考虑为“肌少-骨质疏松症”。此病的最大危害就是增加了骨质疏松性髋部骨折相关并发症的发生，但至今对“肌少-骨质疏松症”的认识不够充分，还需更多的临床及基础实验研究，目前也没有有效的治疗药物，还不能够采取有效的干预措施来预防及治疗此病，这就需要更多的学者及研究人员去寻找有效的治疗或干预靶点，此研究从Ⅱ型肌肉纤维的减少是肌肉减少症的主要特征着手，来探讨Ⅱ型胶原蛋白与骨质疏松的相关性，从而寻找更有力的预防或治疗肌肉减少症和骨质疏松的有效靶点，本研究的结果显示，COL2与骨质疏松呈间接负相关性，而COL2与肌肉减少症呈直接正相关性。

综上所述，Ⅱ型胶原蛋白代谢指标可以有效地预测肌肉纤维和骨质疏松的情况，可反映骨代谢水平，可评估肌肉减少和骨质疏松的程度，预测骨折发生的危险性，从而采取有效的预防措施，减少绝经后女性患者的髋部骨折发生率，甚至降低致残率和死亡率。另外，Ⅱ型胶原蛋白可能是研究绝经后女性骨质疏松患者髋部骨折的治疗靶点，但还需更多的临床及基础实验研究进一步的验证。

本研究的不足之处，此研究的样本量有点少，不能够充分地证明Ⅱ型胶原蛋白与骨质疏松之间的相关性，还需更大的实验样本量，更多的实验数据进一步验证此研究结果。

文章来源：韩衍龙,米尔阿里木·木尔提扎,它依尔江·举来提,赵巍,哈巴西·卡肯,王利.COL2在绝经后女性中的表达与骨质疏松相关性的研究[J].中国骨质疏松杂志,2021,27(09):1269-1273.