骨质疏松症是一种常见的全身性骨代谢疾病，其特征是骨密度降低和骨微结构损伤，导致骨脆性和骨折发生率增加[1,2]。骨处于形成和吸收的动态之中，当骨吸收大于骨形成时，就会出现失衡，从而导致骨质疏松症[3]。临床常用雌激素、降钙素等药物治疗骨质疏松症，但其不良反应大且易引发并发症[4]。中医将骨质疏松症归于“骨痿”“骨痹”等范畴，认为多与肾、肝、脾的亏虚有关，尤以肾虚为本。故临床治疗骨质疏松症以补肾益气、填精生髓兼以活血行气、祛瘀止痛为法[5]。

牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，具有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨等功效，其临床组方如补肾活血方等被大量应用于骨质疏松的治疗[6,7]。药理研究表明，牛膝皂苷可以促进骨形成并抑制骨吸收，而牛膝多糖可以激活Wnt/β-catenin通路，以改善骨代谢[8,9]。牛膝还能通过改善骨矿物质损失来增加骨密度[10]。然而，由于牛膝成分复杂，其改善骨质疏松的作用机制并未完全清晰。

代谢组学可以监测体内给定一组生理条件下生化反应诱导的小分子内源性代谢产物的变化，解释疾病的发病机制，已广泛用于中医药研究[11]。因此，本研究采用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry, UHPLC-Q-TOF-MS)的非靶向代谢组学技术，筛选与牛膝治疗骨质疏松相关的潜在生物标志物并分析其代谢通路，旨在探讨牛膝治疗骨质疏松的作用机制。

1、材料

1.1 实验仪器

6600 Triple TOF型高分辨质谱仪(美国AB SCIEX公司);ExionLC AD型超高效液相色谱仪(美国AB SCIEX公司);5424 R型高速低温离心机(德国Eppendorf公司);1510型酶标仪(美国ThermoFisher公司)。

1.2 药物与试剂

牛膝购于河南省焦作市武陟县，经河南中医药大学陈随清教授鉴定为苋科植物牛膝的干燥根(凭证样本BS631006,存放在河南中医药大学BM633实验室);羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20120330);维甲酸(上海麦克林试剂有限公司);仙灵骨宝胶囊(国药集团同济堂制药有限公司);磷(Pi)比色法试剂盒、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)比色法试剂盒(郑州华禹生物，批号：E-EL-K245-M、E-EL-K091-M);甲醇、乙腈(赛默飞世尔科技有限公司);屈臣氏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.3 实验动物

24只SPF级SD雄性大鼠，体质量180～220 g,购自山东济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK(鲁)20190003,饲养于河南中医药大学动物实验室，室温为20～25℃,相对湿度40%～70%,12 h/12 h昼夜交替，自由进食和饮水。所有动物实验均经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准，审查批准号：DWLL2018080003。

2、方法

2.1 牛膝水煎液的制备

称取洁净干燥的牛膝药材1 000 g,加10倍量的蒸馏水浸泡30 min后加热回流提取1 h,过滤，药渣加8倍量蒸馏水提取1 h,合并两次滤液，减压浓缩为质量浓度1 g·mL-1药液，储存至4℃备用。

2.2 动物分组及给药

SD大鼠适应性喂养1周后，随机分为4组，分别为正常组、模型组、仙灵骨宝组(0.6 g·kg-1)、牛膝组(5.04 g·kg-1)。正常组不给予刺激，模型组及各给药组于每天上午给予1%羧甲基纤维素钠的维甲酸溶液(80 mg·kg-1),连续给药14 d。于模型成功的第2天起，每天上午灌胃给药，连续给药28 d。实验取材前一晚禁食不禁水，收集12 h尿液，离心分装。末次给药1 h后腹主动脉采血，常温静置1 h,待其凝固分层后，于4℃下3 000 r·min-1离心20 min即得血清，避免反复冻融。

2.3 模型评估指标

从皮毛状态、体质量、精神状况等方面观察各组大鼠一般行为学状态，并严格按照试剂盒说明书对各实验组大鼠血清Pi、ALP的水平进行测定。

2.4 血清和尿液样本的制备

精密吸取200μL血清于1.5 mL离心管中，加入4倍量的甲醇■乙腈(1■1)[12,13],涡旋30 s,冰浴超声10 min,置于-20℃ 冰箱静置1 h进行蛋白沉淀。于4℃下12 000 r·min-1离心20 min,取上清液过0.22μm微孔滤膜，即可进样质谱分析。尿液样本制备方法同血清样本。

2.5 质控样本的制备

从上述每个供试品溶液中依次吸取30μL,均匀混合，即得质控样本。

2.6 液相色谱质谱联用仪分析条件

2.6.1 质谱条件

采用电喷雾电离源(ESI),扫描模式为正负离子电离模式，雾化气(Gas 1)和辅助气(Gas 2)分别为60、30 psi,气帘气(CUR)为35 psi,离子源温度为600℃,正离子模式源喷雾电压(ISVF)为5 500 V,负离子模式源喷雾电压为-4 500 V。一级质谱扫描范围为100～1 500 Da,二级质谱扫描范围为50～1 500 Da。

2.6.2 色谱条件

色谱柱为Kinetex®C18(50.0 mm×2.1 mm, 2.6μm)柱，采用A(0.1%甲酸水)-B(乙腈)梯度洗脱血清和尿液样本。血清梯度洗脱程序：0—1.5 min, 3%B;1.5—2.0 min, 3%～20%B;2—4 min, 20%～38%B;4.0—4.5 min, 38%～42%B;4.5—7.0 min, 42%～52%B;7—11 min, 52%B;11.0—11.5 min, 52%～62%B;11.5—14.0 min, 62%B;14.0—14.5 min, 62%～97%B;14.5—16.5 min, 97%B;16.5—19.0 min, 97%～3%B;19—20 min, 3%B。尿液梯度洗脱程序：0—4.5 min, 3%B;4.5—5.0 min, 3%～15%B;5—16 min, 15%～50%B;16—17 min, 50%～90%B;17—18 min, 90%B;18—19 min, 90%～3%B;19—20 min, 3%B。柱温：30℃,流速：0.3 mL·min-1,进样量：2μL。

2.7 数据处理

将液相色谱质谱联用仪测得的原始数据导入XCMS软件进行峰对齐、保留时间矫正、峰提取等预处理，并将预处理后的数据导入SIMCA软件进行偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)及正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA),以变量投影重要性(variable importance in projection, VIP)>1.0,差异倍数(fold change)≥2或≤0.5及P<0.05为标准筛选潜在的生物标志物，根据在线数据库HMDB、Massbank、Metlin等数据库并结合二级碎片离子对筛选出的生物标志物进行鉴定。进一步将筛选出的生物标志物采用MetaboAnalyst 5.0数据库进行代谢通路分析，并使用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)对生物标志物所涉及的代谢通路进行分析。

3、结果

3.1 牛膝改善骨质疏松药效评价

造模结束后，模型组大鼠皮毛暗黄躁乱，弓背明显，活动量减小，食欲明显减退，体质量减轻，眼角出现干燥的血块，而给药组大鼠症状均有所缓解。测定各组大鼠血清Pi、ALP水平，结果显示，与正常组比较，模型组大鼠血清中Pi与ALP的水平均明显升高；与模型组比较，仙灵骨宝组、牛膝组Pi、ALP水平均显著降低，表明牛膝能逆转骨质疏松大鼠血清Pi和ALP的水平，见图1。

图1各组大鼠血清Pi、ALP水平比较  

3.2 多元统计分析

采用PLS-DA和OPLS-DA等多元统计分析方法对各组大鼠血清和尿液样本进行分析，以确定各组大鼠代谢轮廓的差异。PLS-DA结果显示，模型组比正常组、仙灵骨宝组、牛膝组分离明显，表明代谢轮廓发生明显变化，且牛膝组趋近于正常组。进一步对模型进行OPLS-DA分析，结果显示，正常组与模型组明显分离，对模型进行200次随机排列组合实验，表明模型稳健良好，未发生过拟合，见图2、图3。上述结果表明，牛膝能够调节骨质疏松大鼠体内代谢轮廓。

3.3 生物标志物的筛选及鉴定

通过多元统计分析结果发现，不同组别大鼠的代谢轮廓存在明显差异，基于OPLS-DA模型，筛选出VIP>1.0,差异倍数≥2或≤0.5及P<0.05的化合物作为牛膝改善骨质疏松的潜在生物标志物，根据标志物的质荷比、二级碎片、保留时间等信息在HMDB、Massbank、Metlin数据库中进一步鉴定筛选出的标志物，最终从血液和尿液中共鉴定出45个生物标志物(表1、表2)。进一步对生物标志物进行热图聚类分析以更直观地表征不同实验组之间的差异(图4),结果表明这些代谢物能够显著区分不同的实验组，相对于模型组，正常组、仙灵骨宝组和牛膝组聚为一类，但均明显区别于模型组，表明牛膝可通过回调骨质疏松相关生物标志物的表达发挥治疗作用。

图2尿液样本PLS-DA、OPLS-DA及置换检验得分图 

图3血液样本PLS-DA、OPLS-DA及置换检验得分图  

表1牛膝治疗骨质疏松大鼠尿液生物标志物鉴定

图4牛膝治疗骨质疏松相关的血清、 尿液生物标志物聚类热图  

3.4 代谢通路分析

将鉴定到的血清、尿液生物标志物导入MetaboAnalyst 5.0数据库进行代谢通路分析(图5、图6),将impact>0.11,-lg P>0.87作为筛选条件，共获得8条相关的代谢通路，主要涉及组胺酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、泛酸和CoA生物合成、核黄素代谢、精氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成等代谢通路。同时结合KEGG数据库和MetaboAnalyst构建代谢通路网络，对重要信号通路进行关联分析，从整体上解释牛膝改善骨质疏松的可能作用机制。

图5血清、尿液生物标志物代谢通路富集分析图  

图6牛膝治疗骨质疏松的血清、尿液代谢网络图 

4、讨论

骨质疏松症作为一种慢性的增龄型骨骼疾病，严重影响了人们的生活质量。Pi是骨骼重要的组成部分之一，机体对其吸收与调控直接影响骨代谢过程[14]。ALP是一组具有水解和转移活性的细胞膜相关酶，在矿化组织细胞中高度表达，在骨质疏松疾病中ALP水平会有不同程度地升高[15,16]。研究指出，骨质疏松模型小鼠Pi、ALP的水平均明显升高[17],与本研究结果一致，在给予牛膝后二者水平明显降低，表明牛膝可通过降低Pi、ALP的水平改善骨质疏松的症状。

代谢组学反映了基因序列以及基因和蛋白质表达的下游变化，能够筛选与疾病或表型密切相关的生物标志物或治疗靶点，在骨质疏松症的系统研究中发挥着越来越重要的作用[18,19]。因此，本研究基于UHPLC-Q-TOF-MS的非靶向代谢组学技术，通过对牛膝治疗骨质疏松症模型大鼠的血清与尿液样品进行分析，最终鉴定出45个与骨质疏松症相关的生物标志物，主要涉及组胺酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、泛酸和CoA生物合成、核黄素代谢、精氨酸生物合成、烟酸和烟酰胺代谢、色氨酸代谢、类固醇激素生物合成等代谢通路，可以概括为3大类：氨基酸代谢、脂质代谢和氧化应激。

骨质疏松的发生发展与氨基酸代谢紊乱密切相关[20]。组胺作为组氨酸代谢的中间产物，可通过H1和H2受体增加破骨细胞的活性和数量，也能促进成骨细胞的分化和矿化，影响骨吸收[21,22]。色氨酸及其代谢产物影响骨形成，刺激骨髓间充质干细胞的增殖和分化。研究发现，色氨酸可通过色氨酸分解代谢的犬尿氨酸途径在破骨细胞生成中发挥作用[23,24]。谷氨酰胺可通过破骨细胞调节骨代谢，并可以转化为谷氨酸，谷氨酸能通过谷氨酸受体在骨细胞上的表达促进骨吸收[25]。有研究指出，骨质疏松模型大鼠中谷氨酰胺、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、丝氨酸的水平会升高，且缬氨酸的异常代谢可能是骨质疏松症发病的重要机制[26,27,28]。本研究发现，与正常组比较，模型组中组胺、苏氨酸、谷氨酰胺、N-乙酰血清素、L-精氨酸代琥珀酸、缬氨酸、色氨酸等生物标志物的水平均升高，而给予牛膝后这些标志物的水平均显著下降，表明牛膝可通过调节氨基酸代谢紊乱缓解骨质疏松的症状。

脂质代谢异常也与骨质疏松的发病机制有关[29]。脂质是维持细胞功能和细胞增殖的重要物质基础，在骨髓间充质干细胞的分化中起到重要作用[30]。研究发现，干预类固醇激素的生物合成可干预骨质疏松大鼠的内在代谢物，从而改善松质骨结构，提高骨密度，改善骨代谢稳态[31]。此外，雌二醇能显著上调成骨样细胞内抗氧化酶γ-Gcs、Ccs和Ngb的表达，且雌激素可以减少骨和骨髓中的氧化应激，从而维持骨微环境的平衡，将骨强度保持在正常范围内，当雌激素缺乏时会导致骨质疏松发病率增加[32,33,34]。然而，雌二醇和雌酮极易与葡糖醛酸结合，使其水溶性增加，被尿液排出体外[35]。研究表明，柠檬酸的变化是骨质流失或雌激素缺乏的重要标志物，而柠檬酸能在乌头酸酶的作用下可逆地生成异柠檬酸[36]。另外，研究也显示骨质疏松大鼠血清中的雌激素水平降低，在本研究中，模型组大鼠尿液中雌二醇、雌酮、雄甾-4-烯-3,17-二酮、19-氧蒽醌等生物标志物的水平均升高，血清中11a-羟基孕酮含量降低，表明骨质疏松大鼠体内的脂质代谢紊乱导致雌激素随尿液被排出体外致其尿液中水平较高，而给药牛膝后这些代谢物的水平均趋于正常，表明牛膝可通过调节脂质代谢紊乱发挥治疗骨质疏松的作用[37,38]。

氧化应激反应也是影响骨质疏松发病的一个重要机制[39]。核黄素是FMN和FAD两种辅酶的主要活性基因，参与氨基酸代谢、能量代谢和铁代谢等，核黄素代谢异常与多种疾病相关[40]。烟酰胺是烟酸的酰胺形式，不仅参与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的合成，并且是抗氧化防御机制的一部分，还参与细胞炎症的调节[41]。研究显示，氧化应激反应能降低成骨细胞的活性和数量，并促进破骨细胞的形成和增加破骨细胞的活性，引发骨质疏松症的发生[42]。此外，能量代谢是骨组织进行新陈代谢的重要能量来源，而氧化应激可通过参与线粒体能量代谢进而影响骨代谢[43,44,45]。在本研究中，与正常组比较，模型组中核黄素、烟酸和烟酰胺的水平均升高，而给予牛膝后这些代谢物的水平均降低，表明牛膝可改善与骨质疏松相关的氧化应激反应。

牛膝归肝、肾经，有补肝肾、健筋骨、活血化瘀的功效，可用于治疗肝肾亏虚、跌打瘀痛、腰膝酸痛、筋骨无力等，牛膝多糖可以用于治疗骨性关节炎[46]。李开言等[47]研究表明，牛膝多糖含药血清应用于损伤的软骨细胞可提高其增殖活性，对改善骨代谢、防治骨质疏松症具有重要意义。与本研究得出的牛膝通过调节氨基酸代谢紊乱缓解骨质疏松的症状、通过调节脂质代谢紊乱和相关的氧化应激反应发挥治疗骨质疏松的结论相符。

综上所述，本研究从代谢组学角度全面分析牛膝改善骨质疏松的代谢机制，并基于传统药效学指标明确其药效，初步阐释牛膝改善骨质疏松的作用机制，为牛膝的临床合理应用提供了依据。

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基金资助:河南省重大科技专项资助项目(171100310500);

文章来源:赵宏建,刘双晶,李建朋,等.牛膝改善骨质疏松模型大鼠内源性代谢物的作用机制[J].中医学报,2024,39(04):820-827.