骨质疏松症（osteoporosis,OP）作为一种骨科代谢性疾病，病理改变通常表现为骨密度与骨强度的降低，这极大增加了骨折的发生风险。随着医疗卫生的不断改善，人口老龄化日趋加重，OP的患病率逐年升高[1]。目前认为骨代谢紊乱、免疫系统失衡、激素水平改变、遗传因素等是OP重要的致病因素[2]。随着对骨免疫的深入研究，研究者发现，B细胞和T细胞等免疫细胞在维持骨骼健康方面发挥重要作用，受T细胞调节的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）被证明可以加速成骨细胞的凋亡；B细胞产生的破骨细胞分化因子可刺激破骨细胞生成，从而加速骨丢失[2]。此外，有研究发现，骨相关炎性疾病如类风湿关节炎、骨关节炎、牙周炎等均存在骨丢失，骨代谢失衡导致的骨丢失与免疫细胞具有一定的关联[3]。因此，通过对OP的免疫浸润机制研究，可以发现致病性的免疫细胞和免疫功能，并寻找方法对其进行消除或抑制，对治疗OP具有重要意义。

铜在生命过程中是一种不可或缺的元素，它作为酶的辅助因子参与线粒体三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle,TCA）等多种生理途径。研究发现，铜离子与TCA中的脂酰化成分结合，可导致脂酰化蛋白的异常聚集和铁-硫簇蛋白的丢失，从而引发蛋白负荷应激，最终导致细胞死亡[4]。同时，铜也参与免疫系统的多种功能，包括调节先天性免疫细胞的激活，影响组织中免疫细胞的分布等[5]。目前，多个研究发现，铜死亡基因对免疫细胞在组织中的表达具有一定影响，比如对正常膀胱组织与膀胱癌组织的免疫浸润数据分析发现，铜死亡基因的高表达促使T细胞与B细胞等出现高表达[6]；另一项铜死亡基因对克罗恩病的免疫浸润影响机制研究也得到类似的结果[7]。上述研究说明铜死亡可能与免疫系统的调控和炎症反应等过程密切相关。目前，铜死亡引起OP的机制研究虽并不完善，但结合铜死亡基因对免疫细胞的影响以及免疫细胞对骨代谢的影响，可得出铜死亡基因可能通过介导免疫细胞从而对骨代谢平衡产生影响。深入了解铜死亡在免疫浸润中的作用机制，有助于揭示细胞死亡与免疫调节之间的相互关系，为OP的治疗提供新的思路。因此，本研究旨在通过生物信息学方法，深入研究铜死亡基因在OP免疫浸润中的作用。

本研究通过对OP铜死亡基因的筛选，将筛选出的铜死亡基因与免疫细胞及功能之间进行相关分析，同时，分析铜死亡基因与免疫浸润之间的相关性。此外，通过构建风险预测模型，筛选出关键基因并对其进行富集分析和中药预测。通过解析铜死亡基因的潜在功能和与其相互作用的免疫浸润网络，分析中药治疗OP的生物标志物与药物靶点，为中医治疗OP提供理论依据。

1、资料与方法

1.1 相关软件及数据库信息

本次研究使用的软件及数据库的相关信息如下。GEO数据库；Perl语言5.38.0;R语言4.3.1；分子特征数据；miRBase数据库；miRDB数据库；miRWalk数据库；TargetScan数据库；spongeScan数据库;Coremine Medical数据库；Cytoscape软件3.10.1。

1.2 OP原始数据及铜死亡基因获取

以“Osteoporosis”“Gene expression”为关键词，以“Expre-ssion profiling by array”“Homo sapiens”“Series”为限定标准，从GEO数据库下载OP基因表达探针矩阵文件及平台文件。通过对检索结果进一步筛选，最后纳入4个数据集，包括GSE13850、GSE56116、GSE56815和GSE230665，共包含82例OP患者（OP患者组）与66例健康者（健康对照组），数据集分别由GPL570平台、GPL4133平台、GPL570平台、GPL10332平台生成。

检索国内、外文献相关网站，如中国知网、中国生物医学文献数据库，Embase、PubMed等。以“铜死亡”为中文检索词，以“Cuproptosis”为英文检索词，同时追踪纳入研究的参考文献，检索时限均为建库至2023年10月30日。

1.3 数据处理

利用Perl语言对下载的4个数据集进行标准化处理，获得含有基因名的OP矩阵文件，利用R语言的“limma”包（版本3.2）和“SVA”包（版本3.8）对基因表达水平进行标准化处理，并对合并后的矩阵进行批次校正。根据结果绘制批次校正前和批次校正后的主成分分析（principal components analysis,PCA）图，同时输出合并后的基因表达矩阵，对合并输出后的基因进行铜死亡基因筛选，最终获得铜死亡基因表达矩阵。

1.4 免疫细胞和功能的提取与量化

在分子特征数据库中搜索关键词“Immunity”，下载相关数据文件“gmt”，使用R语言中的“GSVA”数据处理包对4个数据集进行合并处理分析，使用单样本基因集富集分析（single-sample gene set en richment analysis,ssGSEA）对合并后的基因表达矩阵进行分析。最后，使用R语言的“pheatmap”包绘制热图。

1.5 免疫浸润的相关性分析

为探索不同免疫细胞间的关联以及不同免疫功能间的关联，运用R语言中的“corrplo”数据处理包进行相关性分析，并联合ssGSEA得出的结果，最终获得免疫细胞间以及免疫功能间的相关性信息。

1.6 免疫浸润的差异性分析

为比较OP患者组和健康对照组中免疫细胞以及免疫功能的差异，将样本的分组信息与ssGSEA表达矩阵结果进行整合。随后，运用R语言的“ggpubr”包进行秩和检验，并以箱线图的形式展示结果，以便筛选出在两组之间存在显著差异的免疫细胞和免疫功能。

1.7 铜死亡基因与免疫浸润及免疫功能的相关性分析

将“1.4”获得的ssGSEA表达矩阵与筛选出的铜死亡基因进行整合，并运用R语言中的“psych”数据包对两者进行相关性分析，使用R语言的“ggcorrplot”包对相关系数进行可视化处理，绘制相关性热图。最后，筛选出与免疫浸润结果具有强相关性的铜死亡基因。

1.8 预测模型的构建与验证

运用铜死亡关键基因表达矩阵中的健康对照组样本和OP患者组样本的分组数据构建Logistic回归风险模型，得到相关风险评分，以风险评分的中位数作为分割点，高于中位数代表高风险，低于中位数代表低风险。再利用R语言的“rms”包，构建风险预测图。并通过校准曲线和受试者工作曲线（receiver operating characteristic,ROC）进行验证，评估模型的准确性。

1.9 GO与KEGG富集分析

运用R语言的“clusterProfiler”包对筛选获得的铜死亡关键基因表达矩阵进行基因本体论（gene ontology,GO）与京都基因与基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）富集分析，将获得的结果再利用R语言的“ggplot2”包进行可视化处理。

1.1 0 潜在中药的筛选预测

在Coremine Medical数据库中逐个检索关键基因和GO富集分析中与免疫浸润相关的生物过程，包括乙酰辅酶A生物合成与代谢、核苷二磷酸生物合成、巨噬细胞凋亡过程、白细胞凋亡过程、干细胞分化、白细胞迁移和白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1）的产生等，筛选“Traditional Chinese Medicine”模块中的信息，以确定其中具有潜在治疗作用的中药。随后采用秩和检验统计分析，并以P<0.01为筛选条件，筛选对各预测靶标具有生物学效应的前10味中药，对中药的四气五味、归经和功效进行统计分析。

2、结果

2.1 铜死亡基因检索结果

通过检索相关文献（4篇[3,4,5,6]）以及相关数据库，共获得19个与铜死亡相关的基因，包括NFE2L2、NLRP3、ATP7B、ATP7A、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、SLC31A1、FDX1、LIAS、LIPT1、LIPT2、DLD、GLS、CDKN2A、DBT、GCSH、DLST。

2.2 PCA分析和铜死亡基因提取

对4个数据集的基因表达水平进行标准化处理后，去除数据集间的批次效应并进行合并，输出合并后的数据集。再根据结果绘制批次校正前和批次校正后的PCA图（图1A）。在批次校正前的PCA图中，不同批次之间存在明显的分离现象。而在批次校正后，批次之间发生重叠，表明批次校正成功地消除了批次效应。再提取该矩阵中的铜死亡基因，共得到18个铜死亡基因组成的表达矩阵（图1B）。

2.3 免疫细胞和免疫功能的浸润情况

本研究共涉及29种免疫细胞和免疫功能的类型，免疫细胞包括活化树突状细胞（activated dendritic cells,aDCs）、B细胞、CD8+T细胞等；免疫功能则包括抗原呈递共抑制、Ⅰ型干扰素反应、Ⅱ型干扰素反应等。使用ssGSEA算法计算合并后的数据集中免疫细胞及免疫功能在各个样本中的表达水平。详见图2。

2.4 免疫细胞间、免疫功能间的相关性

本研究通过分析OP中免疫细胞间的相关性发现，肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TIL）与辅助性T淋巴细胞呈强正相关性（r=0.77）、TIL与CD8+T细胞呈强正相关性（r=0.67）。通过分析OP中免疫功能间的相关性发现，细胞溶解活性与促进炎症活动呈强正相关性（r=0.78）、T细胞共刺激与免疫细胞检查点呈强正相关性（r=0.76）。详见图3。

图1 PCA图

图2 免疫细胞和免疫功能在各样本中的表达水平

2.5 差异性免疫细胞和免疫功能

对OP患者组与健康对照组进行组间免疫细胞差异分析，P<0.05则代表差异具有显著性。结果显示，未成熟树突状细胞、巨噬细胞在OP患者组中显著表达（P<0.01），而滤泡辅助T细胞在健康对照组中显著表达（P<0.01）。对OP患者组与健康对照组进行组间免疫功能差异分析，P<0.05则代表差异具有显著性。结果显示，趋化因子受体、组织相容性复合体Ⅰ在OP患者组中显著表达（P<0.01）。详见图4。

2.6 铜死亡基因与免疫浸润的相关性

对OP铜死亡相关基因与免疫浸润结果进行相关性分析，见图5。结果显示，多个铜死亡基因如SLC31A1、PDHB、PDHA1、NFE2L2等与多个免疫细胞及功能之间存在显著的相关性。将上述基因作为本次研究的关键基因，用于后续的风险预测模型、KEGG和GO富集分析等。

2.7 预测模型的构建

从构建的风险预测模型中可看出铜死亡基因SLC31A1最有可能是导致OP的风险因子。ROC曲线评估可见AUC值为0.72，大于0.6，说明预测模型的列线图具有较高的准确性，具有高度的诊断效能。校正曲线显示，其与理想曲线拟合较好，说明预测模型在预测准确性方面表现出了很高的可信度。详见图6。

图3 免疫细胞间、免疫功能间的相关性  

图4 差异性分析箱线图

图5 铜死亡基因与免疫浸润相关性分析热图  

图6 OP的预测模型结果图

2.8 GO与KEGG富集分析

对13个关键基因进行GO和KEGG富集分析。GO富集分析结果表明，关键基因主要富集在乙酰辅酶A生物合成与代谢、核苷二磷酸生物合成、巨噬细胞凋亡过程、白细胞凋亡过程、干细胞分化、白细胞迁移和IL-1的产生等生物过程中；在细胞成分上，主要有线粒体基质、氧化还原酶复合体和TCA酶复合体；分子功能方面，主要在氧化还原酶活性、过渡金属离子跨膜转运体活性和酰基转移酶活性中发挥作用（图7）。分析结果显示，在所有生物过程中，巨噬细胞凋亡过程、白细胞凋亡过程、干细胞分化、白细胞迁移和IL-1的产生与免疫浸润关系密切。KEGG富集分析结果表明，OP的关键基因主要在脂肪酸代谢、TCA、2-酮羧酸代谢和丙酮酸代谢中被激活（图8）。

图7 GO富集分析结果（前6项）

图8 KEGG富集分析结果

2.9 中药预测结果

通过Coremine Medical数据库，以P<0.01作为筛选标准，对关键基因和免疫浸润相关的生物过程进行中药预测，共得到156种中药。为了更好地展示预测结果，将结果导入Cytoscape软件，创建可视化网络图。该网络中排名前10位的中药为鱼鳔胶、鱼脑石、柴胡、姜黄、郁金、灵芝、人参、甘草、黄芪和白术（图9），表明它们是治疗OP的主要药物。四气五味、归经与功效分析结果显示，药物四气多属温、平，五味多属甘，归经主要集中在肾、脾经，功效多为补气、健脾、补肾、活血、行气和止痛（图10）。

3、讨论

OP为一种全身性代谢性疾病，其主要特征在于骨骼系统的不平衡状态。骨骼系统与免疫系统之间存在紧密的关联，免疫细胞在调节骨代谢中扮演着重要角色，如B细胞参与骨吸收和骨形成的调节、T细胞则通过调控炎症反应和细胞信号传导对骨骼健康产生影响[8,9]。此外，与免疫系统相关的因素也可能在OP的预防和管理中扮演关键角色[10]。因此，识别和探讨OP免疫相关的分子机制对其治疗具有重要意义。

图9 中药预测网络图

图1 0 中药筛选与分析结果

本研究通过分析免疫细胞间和免疫功能间的相关性发现，OP与免疫系统之间存在紧密关联。我们发现TIL与辅助性T细胞、TIL与CD8+T细胞之间存在强正相关性，表明它们在OP中的协同作用可能有助于维持骨质的稳定性。辅助性T细胞可通过调节TIL的免疫反应，发挥维持骨骼健康的作用，而CD8+T细胞则在清除受损细胞方面发挥关键作用[11,12]。对于免疫功能的相关性分析发现，细胞溶解活性与炎症促进活动之间存在强正相关性，表明免疫系统的活性和免疫调控之间存在密切的互动。细胞溶解活性代表免疫系统清除异常细胞的潜力，而炎症促进活动则涵盖了免疫系统引发炎症的功能。这种正相关性提示，细胞的溶解和炎症过程可能存在相互促进作用[13]。另外，T细胞共刺激与免疫细胞检查点也呈强正相关性，表明T细胞的激活和免疫调节之间存在动态平衡。T细胞共刺激代表T细胞相互协作的过程，而免疫细胞检查点则代表免疫系统中的一种负性调控机制，这种相关性对于维持免疫平衡和骨骼健康至关重要[14]。

通过分析免疫细胞和免疫功能的差异性发现，免疫系统的异常活跃状态可能是导致OP发生发展的重要原因。在OP患者中，树突状细胞、巨噬细胞、趋化因子受体、组织相容性复合体Ⅰ表达显著增加。其中树突状细胞可以通过呈递抗原和激活T细胞的方式引发免疫反应，然而在OP病理情况下，树突状细胞可能异常激活T细胞，诱发T细胞产生炎症因子，进而导致骨质吸收增加[15]。巨噬细胞在炎症条件下，会分泌肿瘤坏死因子和IL-1等炎症介质，进而促进成骨细胞的凋亡和骨吸收[16]。本研究结果发现，趋化因子受体和组织相容性复合体Ⅰ显著表达，说明OP患者的免疫系统处于高度活跃状态，可能导致免疫细胞进入骨组织并产生细胞毒性效应。这些细胞会攻击健康的骨组织并引发骨骼中的细胞凋亡和溶解，导致骨质丢失[17]。在健康对照组中，滤泡辅助T细胞的显著表达反映了其在维持正常骨骼健康中的重要作用。滤泡辅助T细胞通常参与抗体产生和细胞免疫应答，在淋巴组织中的定位使其能够调控局部免疫应答并产生抗体，有助于维持骨骼的免疫平衡，确保不会发生过度的骨质吸收或不适当的免疫反应[12]。

为进一步探究铜死亡在OP免疫浸润方面的机制，运用风险模型筛选出与OP免疫浸润相关的13个铜死亡基因，包括SLC31A1、PDHB、PDHA1、NFE2L2、LIPT1等，其中SLC31A1最有可能是导致OP的风险因子。研究发现[18,19,20],SLC31A1和ATP7B编码铜转运蛋白，有助于维持免疫细胞内的铜平衡，进而维持其抗氧化和免疫功能；在OP中，SLC31A1和ATP7B的异常表达会导致免疫细胞内铜供应不足，降低其抗氧化能力，导致细胞更容易受到氧化应激的损害，并影响免疫细胞的相互作用和信号传导。PDHB、PDHA1、DLD和DLAT编码的线粒体脱氢酶在免疫细胞中参与葡萄糖代谢和线粒体呼吸，并提供所需的能量和功能，而免疫细胞在激活状态下具有高能量需求，因此，异常的葡萄糖代谢和线粒体功能会对免疫细胞的活性和功能产生不利影响，继而影响骨代谢[3,21]。LIPT1与脂质代谢和细胞膜组成紧密相关，细胞膜的组成对于免疫细胞的功能和信号传导至关重要，而异常的脂质代谢会导致细胞膜受损、信号传导异常以及免疫平衡紊乱，进而干扰免疫细胞对骨组织的免疫反应[22]。CDKN2A编码细胞周期抑制蛋白，对细胞的增殖和生存起调控作用，然而，CDKN2A的过表达会导致免疫细胞的数量减少、功能降低，从而对OP的免疫反应产生影响[23,24]。上述基因都有可靠的证据支持其参与调控铜死亡，但关于NFE2L2、GLS、GCSH、FDX1和DBT调控铜死亡在OP中的作用研究尚未见报道。综合本研究结果发现，铜和铜死亡相关基因介导免疫细胞的功能、代谢和抗氧化反应，对OP免疫浸润产生影响，进一步提示铜死亡与OP发病机制密切相关。

中医学并无OP病名，根据其临床症状及病因病机特点，可将其归属于“骨痿”的范畴。目前，临床上将OP分为肾虚血瘀证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证、气滞血瘀证和脾肾阳虚兼血瘀证[25]。本研究对铜死亡基因进行相应的中药预测发现，筛选出的药物药性主要为温，药味主要为平、甘，归经主要为肾、脾、肺经，功效主要为补肾、健脾、补气等，这与上述病机相对应，并且有中医学者[26]认为“以补肾壮骨、益精填髓为主，健脾益气、和胃助运为辅”是治疗OP的主要方法，由此可见本次通过基因筛选出的药物具有一定的准确性。

目前，尚未见生物信息学结合预测中药技术与证候实质相关的研究报道。本研究运用生物信息学筛选OP铜死亡基因、预测中药，将有望为其证候实质研究提供前期理论基础。

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基金资助:国家自然科学基金项目(82360937);广西中医药大学A类“桂派中医药传承创新团队”(2022A004);

文章来源:宋世雷,陈跃平.骨质疏松症铜死亡基因的免疫浸润分析及潜在中药预测[J].湖南中医药大学学报,2024,44(06):1100-1109.