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浅谈海洋细菌的鉴定与抑菌谱分析
摘要：本次实验指示菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、弧菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和鲍曼不动杆菌；实验材材料样品为来源于北冰洋沉积物的海洋细菌，共计11种，通过琼脂扩散法进行实验研究后，选取了其中效果最好的菌进行鉴定。鉴定结果：其为芽孢杆菌。
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自然界寻找高效的能够抗人类病原菌、动物病原菌的的化合物一直是研究者的热点之一，如何从天然资源中筛选和研发新型的抗生素，也是最近研究的趋势。海洋微生物由于生存环境具有低温、高压、黑暗等特殊性，可能会产生结构新颖、作用机制独特的活性代谢产物，因此成为了近年来研究的热点之一［1－3］。本实验以9种人类和动物致病菌致病菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌）为指示菌，研究海洋微生物的抑菌谱，并进行鉴定，为进一步研究其相关次级代谢产物以及其抗菌活性物质奠定基础，其应用前景广阔丰富。
1、材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料海洋沉积物样品采集泥样为中国第六次北极考察沉积物样品。指示菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、弧菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和鲍曼不动杆菌，实验室保藏。
1.1.2 试剂PCR试剂，购自大连宝生物公司。其他生化试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基LB培养基：酵母提取物5g，胰蛋白胨10g·L－1，琼脂20g，氯化钠5g，去离子水1000mL，pH约为7.0。营养肉汤（NB）培养基：18g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH约为7.0。脑心浸液肉汤（BHI）培养基：38.5g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH约为7.0。MRS培养基：52.2g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH约为7.0。
1.1.4 仪器与设备ZWY－A2102C双层可编程恒温摇床，上海智诚分析仪器制造有限公司；BSA224S电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；RE－52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SW－CJ－2FD洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；MT－180B生化恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；DHG－9070A电热恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；HVE－50高压灭菌器，日本HIRAYAMA公司。
1.2 实验方法
1.2.1 海洋微生物的分离
菌株的分离采用涂布平板法，具体操作如下：称取海洋沉积物样品0.5g，加入60％的海水4.5mL，混匀后静置2h，取0.5mL混合物，加入4.5mL海水中，梯度稀释成7个不同的浓度，取10－7至10－4的稀释浓度，每个浓度取样50μL，用玻璃棒在培养皿上涂布。将培养皿放在培养箱中28°C培养1～2d。然后用接种针挑取形态不同的单菌落，在培养箱中28°C培养2～3d，分离出单菌落［4］。
1.2.2 制备海洋微生物粗发酵液
将菌株按0.1％的接种量接种到海水配制的200mL的LB培养基中，摇床培养24h，（37°C，180r／min），离心10min（6000r／min、4°C），取上清。然后用旋转蒸发仪在50°C下旋蒸至干，用药匙抠出，加入3mL超纯水，将浓缩液经0.22μm无菌微孔滤膜过滤，得到粗发酵液。
1.2.3 抑菌谱的测定
采用琼脂扩散法测定发酵液对9种病原微生物（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌）的抑菌活性。6种常见病原微生物（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌）应用LB培养基；肺炎克雷伯菌应用NB培养基；鲍曼不动杆菌应用BHI培养基；屎肠球菌应用MRS培养基。微波炉将培养基融化后，室温放置至40°C左右，接入100μL的病原微生物，轻摇混匀后倒平板，待平板凝固后用9mm的打孔器打孔，量取300μL海洋微生物的粗发酵液，加入打好的孔中，37°C培养24h后，用游标卡尺测量每个抑菌圈的直径。实验重复3次。
1.2.4 菌种的鉴定
将挑选的抑菌效果好的菌株进行平板划线法进行活化，活化产物送到宝生物公司进行鉴定。将测序结果在GenBank中，通过BLAST进行比对，获得相似度较高的序列。将此序列与所测序列通过ClustalX进行比对，最后利用MEGA6.0软件，构建出系统发育树，以确定该菌株的分类地位［5］。
2、结果与分析
2.1 抑菌谱测定结果
11株海洋细菌的抑菌谱测定结果如表1所示（注：打孔器直径9mm）。由表1可以看出，65号菌株具有较广的抑菌谱，对大肠杆菌，沙门氏菌，弧菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌表现为低度敏感；对肺炎克雷伯菌表现为中度敏感.
2.2 65号菌株的鉴定结果
将序列同NCBI基因库里面记载的所有己测定生物的Nucleotidecollection比较，根据供试系统发育树可以看出，65号菌株为芽孢杆菌。
3、结论
本实验采用琼脂扩散法研究了11种来源于北冰洋沉积物的海洋细菌对9种人类和动物致病菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，白色念珠菌，弧菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌，肺炎克雷伯菌，屎肠球菌，鲍曼不动杆菌）的抑菌谱。发现65号菌株具有较广的抑菌谱，对大肠杆菌，沙门氏菌，弧菌，铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌表现为低度敏感；对肺炎克雷伯菌表现为中度敏感。经过鉴定，确定其为芽孢杆菌。随着畜禽规模化养殖业的发展，大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等已成为畜禽养殖场的主要病原菌，由这些病原性引起的疾病成为畜禽规模化养殖业的常见病［6－7］。而大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌等也会引起人类的疾病。本实验筛选出的65号菌株，来源于深海，有可能会产生不同于陆生微生物的特殊的抑菌活性物质。具体有待于进一步的研究。
参考文献：
[1]金黎明,金鑫浩,侯熙彦,等.具有抗菌活性的海洋真菌天然产物研究进展[J].中国海洋药物,2017,36(4):66-74.
[2]张静楠,聂灿玉,赵胜楠,等.抗白色念珠菌的海洋微生物的分离与鉴定[J].天津农业科学,2016,22(1):79-81.
[3]王硕,孟庆丽,武天娇,等.抗金葡菌深海真菌的分离鉴定及抑菌谱研究[J].生物技术,2015,25(2):169-172.
[4]白建,曹靖,王汝都,等.24味中药水提物对宠物犬源致病性大肠杆菌NJ-1株体外抑菌试验研究[J].黑龙江畜牧兽医,2018,(15):177-179.
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汪浩,孙怡,李思琪,李成伟,邢恩波,秦香,金黎明.海洋细菌的抑菌谱研究及鉴定[J].山东化工,2019,48(2):6-7.
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2020-05-28我要评论
期刊名称：海洋学研究
期刊人气：1252
主管单位：国家海洋局
主办单位：中国海洋学会,国家海洋局第二海洋研究所,浙江省海洋学会
出版地方：浙江
专业分类：科学
国际刊号：1001-909X
国内刊号：33-1330/P
创刊时间：1983年
发行周期：季刊
期刊开本：16开
见刊时间：一年半以上
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2020-02-14
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上传者：管理员
