后循环缺血（posterior circulation ischemia,PCI）包括后循环的短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack,TIA）和脑梗死，可引起广泛症状，典型的表现包括眩晕、步态共济失调、视觉缺陷（包括偏盲）、眼球运动障碍，非典型症状包括单侧肢体无力，呼吸、心率和血压紊乱，与前循环缺血的症状有大量重叠[1]。据全球疾病负担研究，脑卒中已成为2019年全球第二大死亡原因（占总死亡人数的11.6%),2019年脑卒中的全球发病人数为12 200万，缺血性卒中占2019年新发卒中的62.4%，其中PCI占所有缺血性卒中的20%～25%，年发病率为18/100000人[2]。随着人口老龄化的加剧，PCI发病率逐年升高，由于该病致残致死性高，严重威胁患者的生命安全和家庭经济状况，加重社会负担。早期发现、诊断、干预可改善缺血情况，阻止其进一步发展，避免卒中的发生。研究表明，血管和神经新生与缺血性脑血管病的功能结局改善相关，增强血管新生和神经发生是治疗缺血性脑血管病的潜在治疗策略[3,4,5]。针刺作为安全有效的治疗手段，在缺血性脑病中能够发挥神经保护作用，研究证实针刺治疗PCI有效，能够显著改善PCI患者眩晕等相关症状，恢复患者脑血流量并改善神经功能[6,7,8,9]。因此，本研究采用动物实验，研究颈椎横突尖电项针法对PCI大鼠血管新生和神经发生的调控作用及相关机制。

1、材料和方法

1.1 实验动物

无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级健康雄性SD大鼠32只，体质量250～280 g，购于河南省惠济区华兴实验动物养殖场[实验动物生产许可证号：SCXK（豫）2019-0002]，饲养于安徽中医药大学针灸经络研究所动物房，温度21～25℃，湿度60%～65%。所有实验操作均严格按照中国伦理委员会有关动物研究的指导原则进行，该方案经过安徽中医药大学伦理委员会批准（伦理编号：AHUCM-rats-2022138）。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

二甲苯购于天津凯通化学试剂有限公司（批号：20221123）；无水乙醇购于上海广诺化学科技有限公司（批号：20221009）；苏木精染液、醇溶伊红染液、中性树胶、山羊抗兔IgG-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）、抗荧光淬灭封片剂均购于安徽欣乐生物技术有限公司（批号：12062216、11182209、12052215、12102209、12052216）；抗荧光淬灭封片剂购于英国ebiogo公司（批号：12052216）；兔抗神经元特异性核蛋白（NeuN）抗体、兔抗大鼠内皮抑素（endostatin,ES）抗体均购于英国abcam公司（批号：GR3275122-22、GR3215026-9）；兔抗神经巢蛋白（Nestin）抗体、兔抗大鼠血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）抗体、兔抗大鼠碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）抗体均购于北京博奥森生物技术有限公司（批号：AF03297105P、AF11182863P、AG09113492）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG均购于北京中杉金桥生物技术有限公司（批号：140193、202700514）；兔抗大鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9）抗体购于美国Bioworld公司（批号：BS1241）；尼莫地平片购于山东新华制药股份有限公司（批号：H10910081）。

1.2.2 主要仪器

一次性无菌针灸针（0.25mm×13mm）购于苏州医疗用品厂有限公司；KWD-808I脉冲针灸治疗仪购于常州英迪电子医疗器械有限公司；JW-3021HR高速冷冻离心机购于安徽嘉文仪器装备有限公司；YB-7LF生物组织包埋机购于湖北亚光医用电子技术有限公司；RM2016徕卡切片机为德国Leica公司产品；CX41显微镜购于日本OLYMPUS公司；Pannoramic MIDI数字切片扫描仪为匈牙利3DHISTECH公司产品。

1.3 方法

1.3.1 PCI模型制备与评价

参照文献[10,11]的方法，结扎大鼠右侧颈总动脉（right common carotid artery,RCCA）和右锁骨下动脉（right subclavian artery,RSA）复制PCI模型。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液（0.3 mL/100 g）麻醉后，仰卧位固定，备皮消毒后剪开颈部正中偏右侧皮肤，钝性分离肌肉，找到右侧颈动脉鞘，暴露并分离RCCA，穿线备用，沿RCCA近心端向胸腔方向寻找其与RSA的分叉，剥离干净后用玻璃分针小心勾出RSA，随后穿线结扎，继续结扎RCCA，逐层缝合皮肤。操作过程中应小心避免损伤周围血管及伴行的迷走神经。缝合完毕后肌肉注射庆大霉素0.3 mL，同时伤口局部浸润庆大霉素0.2 mL防止感染。结扎完毕后即用超声多普勒仪检测大鼠脑血流量，脑血流量下降为正常值的20%即判定造模成功。术中使用电热毯保持大鼠体温在（37.5±0.5）℃，术后分开放回笼中饲养。

1.3.2 分组与治疗

造模前随机分出8只为假手术组，仅暴露大鼠RCCA和RSA，不结扎。随后复制PCI模型，取造模成功大鼠24只，按随机数字表法分为3组：模型组、西药组、颈椎横突尖电项针组，每组8只。

1.3.2. 1 颈椎横突尖电项针组

抓取大鼠捆绑于鼠板上，根据大鼠解剖学图谱，确定大鼠风池（寰椎翼前缘的直上方凹陷内）和C2、C4、C6双侧横突尖位置，碘伏标记消毒后，使用规格为0.25 mm×13 mm的华佗牌无菌针灸针，风池斜向内上方刺2～3mm,C2、C4、C6双侧横突尖直刺0.3～5 mm。进针后接通KWD-808I脉冲针灸治疗仪，将两组治疗导线分别连接同侧的C2、C6横突尖针柄处，选用疏密波形，频率4Hz，电流2mA，以针柄微微颤动为度，持续刺激30min,1次/d,6次为1个疗程，1个疗程结束后休息1 d，共治疗2个疗程。

1.3.2. 2 西药组

使用尼莫地平溶液灌胃，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”确定大鼠灌胃药量，尼莫地平片以蒸馏水溶解，混合成0.01 g/mL浓度的溶液，灌胃1次/d，时间进程与疗程与颈椎横突尖电项针组一致。

1.3.2. 3 模型组

不予任何针刺治疗，但在颈椎横突尖电项针组进行针刺治疗的相同时间内，对该组大鼠进行抓取、捆绑和固定，确保时间、条件与颈椎横突尖电项针组相同。

1.3.2. 4 假手术组

与模型组处理一致。

1.3.3 观察指标

1.3.3. 1 ZeaLonga神经功能评分

分别在造模后2 h和治疗第7、14天进行神经功能评分，具体参照ZeaLonga神经功能评分表：0分：没有神经功能缺损；1分：提尾时前肢屈曲；2分：行走时大鼠向一侧转圈；3分：行走时大鼠身体向一侧（瘫痪侧）倾倒；4分：意识丧失，不能自行行走。

1.3.3. 2 超声多普勒脑血流量检测

分别在治疗前、造模后2 h和治疗14 d后检测大鼠脑血流量。大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液（0.3mL/100 g）麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪上，备皮消毒后行纵向正中偏右切口，钝性分离皮下组织，暴露颅骨，用棉签蘸取过氧化氢溶液擦拭止血。脑立体定位仪定位人字缝后侧2 mm，矢状缝右侧2 mm处并固定探头，打开PSW软件检测脑血流量记录结果，稳定后记录数值，以血流量/时间曲线显示，并以单位时间内的血流量平均值（perfusion units,PU）进行统计。

1.3.3. 3 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色观察大鼠右侧大脑皮层脑组织形态学改变

治疗结束后大鼠断头取脑，去除多余脑组织后以4%多聚甲醛固定24 h，脱水、浸蜡、包埋后行4μm切片，脱蜡、梯度水化，滴加苏木精染液浸染5 min,1%盐酸乙醇分化、漂洗、返蓝，伊红染液复染10～15 s，透化、封片后镜下观察梗死灶情况。

1.3.3. 4 FITC-Dextran毛细血管密度测定

治疗结束后大鼠麻醉，经尾静脉注射FITC-Dextran 0.1 mL，作用10 min后断头取脑，取右侧大脑皮质，研磨匀浆后离心，取上清液，以荧光酶标仪检测各组上清液的光密度（optical density,OD）值。

1.3.3. 5 免疫荧光染色检测右侧大脑纹状体中Nestin、NeuN的阳性表达

治疗结束后取大鼠右侧纹状体，经固定、脱水、石蜡包埋、切片、烤片、脱蜡、抗原修复、透化、封闭后，滴加一抗（NeuN/Nestin）孵育60min，冲洗后滴加山羊抗兔免疫荧光二抗（稀释比例：1:600），避光孵育30 min，冲洗后用抗荧光淬灭封片剂封片，采用数字切片扫描仪扫描。

1.3.3. 6 免疫印迹法检测大鼠右侧大脑皮质VEGF、bFGF、MMP-9、ES蛋白表达

取大鼠右侧大脑皮质，裂解后提取蛋白并测定蛋白浓度，电泳、转膜、封闭，随后分别加入兔抗VEGF（稀释比例：1:1 000）、兔抗bFGF（稀释比例：1:1 500）、兔抗MMP-9（稀释比例：1:1 000）、兔抗ES（稀释比例：1:1 000),4℃孵育过夜，次日洗膜后加入山羊抗兔IgG（稀释比例：1:5 000），室温孵育后加入增强化学发光液显影。采用Image J软件计算目的条带与相应内参条带灰度值的比值，作为目的蛋白的表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 27.0统计软件进行统计学分析。服从正态分布且方差齐的计量资料，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用最小显著性差异法（least significant difference,LSD）分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组大鼠神经功能评分比较

假手术组大鼠无神经功能缺损症状。造模前，四组神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。造模后2 h，与假手术比较，模型组、西药组和颈椎横突尖电项针组均出现神经缺损症状，神经功能评分均升高（P<0.01）；模型组、西药组和颈椎横突尖电项针神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。治疗7、14 d后，与假手术组比较，模型组仍然有明显的神经缺损症状，模型组神经缺损评分升高（P<0.01）；与模型组比较，西药组和颈椎横突尖电项针组神经功能评分下降（P<0.05,P<0.01）；药物组和颈椎横突尖电项针组神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。  

表1 各组大鼠神经功能评分比较 

2.2 各组大鼠平均脑血流水平比较

造模前各组大鼠脑血流量差异无统计学意义（P>0.05）。治疗14 d后，与假手术组比较，模型组大鼠脑血流量明显减少（P<0.01）；与模型组比较，西药组和颈椎横突尖电项针组的大鼠脑血流量明显增加（P<0.01）；西药组与颈椎横突尖电项针组大鼠脑血流量差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠缺血皮质HE染色结果比较

光镜下观察可见，假手术组大鼠缺血半暗带脑组织形态均正常，神经细胞排列规则，结构完整，胞质均匀、淡染，核仁清晰；模型组大鼠缺血区脑组织结构紊乱，存在大量空泡，神经细胞数量明显减少，部分神经细胞水肿、溶解，胞质疏松，细胞核固缩、深染。与模型组比较，西药组和颈椎横突尖电项针组大鼠缺血区神经细胞结构形态有所改善，组织空泡减少，细胞排列较为整齐，胞核基本正常。见图1。  

表2 各组大鼠脑血流量比较  

图1 各组大鼠右侧大脑皮质脑组织形态（HE染色，400×）   

2.4 各组大鼠纹状体Nestin、NeuN阳性表达比较

假手术组大鼠右侧纹状体内Nestin、NeuN呈低表达。与假手术组比较，模型组大鼠纹状体内Nestin、NeuN表达增高（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较，西药组和颈椎横突尖电项针组Nestin、NeuN表达进一步增高（P<0.05,P<0.01）。与西药组比较，颈椎横突尖电项针组大鼠右侧纹状体Nestin、NeuN阳性表达增高（P<0.05）。见图2。

2.5 各组大鼠缺血区毛细血管密度比较

与假手术组比较，模型组、西药组和颈椎横突尖电项针组大鼠毛细血管密度增高（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较，西药和颈椎横突尖电项针组毛细血管密度进一步增加（P<0.05）。西药组与颈椎横突尖电项针组毛细血管密度差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

2.6 各组大鼠缺血区大脑皮质VEGF、bFGF、MMP-9、ES蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组大鼠缺血区大脑皮质VEGF、bFGF、MMP-9、ES蛋白表达明显增加（P<0.01,P<0.05）。与模型组比较，西药组和颈椎横突尖电项针组大鼠缺血区皮质VEGF、bFGF蛋白表达进一步增加（P<0.01),ES、MMP-9蛋白表达明显减少（P<0.01）。西药组与颈椎横突尖电项针组比较，VEGF、bFGF、MMP-9、ES蛋白表达差异均无统计学意义（P>0.05）。见图4。

图2 各组大鼠大脑右侧纹状体内Nestin、NeuN表达   

图3 各组大鼠缺血区毛细血管OD值表达比较   

图4 各组大鼠缺血区大脑皮质VEGF、bFGF、MMP-9、ES的蛋白表达比较  

3、讨论

后循环系统即椎基底动脉系统，供应脑干、丘脑、小脑、大脑枕叶、颞叶内侧的血液[1,12]。PCI最常发生在延髓、脑干、小脑上部、大脑颞叶及枕叶[13,14]。当缺血性脑损伤发生时，血流灌注不足导致脑组织缺乏氧气和营养物质，致使缺血核心区神经元死亡。然而，此时缺血半暗带中的神经元仍有部分血流灌注，及时恢复血流可以挽救半暗带脑组织。新生血管形成有助于恢复缺血区域的血供，提供氧和营养支持，从而挽救缺血半暗带神经元，促进神经功能恢复[15]。另外，新血管的产生促进了高度耦合的神经恢复过程，包括神经发生和突触发生。动物实验表明，成年大鼠脑缺血损伤后，其侧脑室下区（subventricu⁃lar zone,SVZ）的神经母细胞发生增殖，并沿着血管支架向卒中侧纹状体迁移，在纹状体中分化为成熟神经元并进行功能整合，最终迁移到缺血损伤区，取代受损的神经细胞，从而促进功能性神经元恢复[16,17,18,19,20]。纹状体是新生神经元进行功能整合的关键区域，大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlu⁃sion,MCAO）模型大鼠的新生神经元在纹状体分化为功能性氨基丁酸能（GABAergic）和胆碱能神经元[21,22]。另一项研究显示，缺血诱导的新生纹状体投射神经元可以形成针对黑质投射的长轴突，且具有完整的从神经末梢到细胞体的轴突运输，意味着新生神经元建立了新的纹状体黑质神经回路，与成年大鼠脑内的局部神经网络进行功能整合[20]。与动物研究一致，缺血性脑卒中刺激成人SVZ神经母细胞增殖，经过横向迁移，神经母细胞在受损的纹状体中分化为成熟神经元，并与邻近的纹状体细胞形成突触。缺血后第18天，在梗死周围纹状体中观察到神经母细胞在血管周围聚集，并沿着纹状体中的血管形成链状结构，表现出典型的移行形态。血管新生与神经发生关系密切，调控缺血性卒中后神经发生的整个过程，对神经元的增殖、存活、分化和迁移起着重要作用。VEGF、bFGF作为关键的促血管生成因子，在缺血损伤中不仅能直接诱导神经发生，还能发挥神经保护作用。bFGF诱导短暂局灶性缺血大鼠侧脑室和纹状体细胞增殖增加，而神经母细胞存活取决于卒中后成熟的血管网络形成[23]。Issa等[3]发现，缺血性脑卒中患者半球梗死核心区和半暗带灰白质中bFGF蛋白表达均增加，且卒中受损脑组织血管新生与患者生存期呈正相关，这提示bFGF水平上调是诱导受损区域血管新生和神经保护的机制之一。VEGF通过增加缺血性损伤纹状体中反应性星形胶质细胞的神经元分化，促进脑缺血性损伤成年大鼠纹状体神经发生，鼻内递送VEGF能够有效减少MCAO大鼠脑梗死体积，促进行为恢复，增强脑血管生成[24,25]。

在短暂性全脑缺血大鼠模型中，bFGF通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target protein of rapamycin,mTOR）通路抑制缺血引起的过度自噬和细胞凋亡，实现对大鼠海马CA1区的神经保护作用[26]。此外，多项证据表明血管新生和神经发生改善缺血性脑损伤的功能预后，缺血半暗带微血管密度的增加与生存时间正相关，通过共移植神经和血管祖细胞进行神经血管恢复，可减轻大鼠缺血性卒中后的功能缺损，这提示调控缺血区血管和神经新生可能是治疗脑缺血疾病的前景策略[5,27,28,29]。

针刺可以减轻MCAO大鼠缺血半暗带神经元的死亡，通过神经可塑性的良性调节来促进中风后的功能恢复[30,31]。丁玲等[32]发现，电针刺激局灶性脑缺血再灌注模型大鼠的双侧合谷穴，可降低大鼠脑内ES蛋白的表达，提示电针可能通过下调血管抑制因子的表达，促进局灶性脑缺血再灌注后的血管新生。尤艳利等[33]研究证实，电针诱导局部脑缺血大鼠内皮细胞的表达，说明电针促进脑缺血状态下的血管生成。颈椎横突尖针刺法取穴包括双侧风池和C2、C4、C6横突尖，因为椎动脉V2横段走行于C6～C2横突孔，针刺双侧C2、C4、C6横突尖，与椎动脉V2段走行相吻合，可有效松解颈椎横突局部软组织附着物，减轻因外伤劳损等造成的炎症水肿压迫，从而改善后循环供血情况[34]。此外，PCI最常见的症状为眩晕，风池穴为治风要穴，是治疗眩晕的主穴，针刺风池穴能够增加基底动脉血流量，对该穴进行针刺预处理可诱导大脑缺血耐受，实现对脑组织的保护[35]。

本研究结果提示，颈椎横突尖电项针法可以改善PCI大鼠脑血流量和神经功能。针刺可能通过调节血管新生相关的蛋白表达，实现对血管新生和神经发生的调控，从而减轻PCI大鼠的缺血和神经功能损伤。该法取穴简便精练，危险性低，有利于提高患者的依从性和信任度。因此，颈椎横突尖电项针疗法可以作为PCI的一种潜在治疗手段。

参考文献:

[6]甘莉.针刺结合半夏白术天麻汤治疗后循环缺血疗效观察[J].实用中医药杂志,2022,38(6):911-913.

[7]何玉伟,周炜.后顶穴搓针导气法治疗后循环缺血的临床研究[J].内蒙古医科大学学报,2021,43(4):364-368.

[8]罗蛟龙,张阳普,夏文广.百会穴压灸联合针刺治疗后循环缺血性眩晕临床观察[J].上海针灸杂志,2020,39(9):1138-1141.

[9]王甜,孟智宏.以风池为主针刺治疗椎基底动脉供血不足的研究进展[J].针灸临床杂志,2013,29(8):66-68.

[10]刘阳,孙建宁,王堃,等.缺血性眩晕大鼠模型的建立[J].中国比较医学杂志,2013,23(1):10-13.

[11]王立宇,刘淑云,肖茂春,等.电针对急性后循环缺血豚鼠蜗神经核能量代谢功能重塑的影响及机制研究[J].听力学及言语疾病杂志,2023,31(1):39-43.

[14]刘丰,韩巨.后循环缺血的诊断和急性期治疗的研究进展[J].中风与神经疾病杂志,2016,33(11):1048-1050.

[32]丁玲,陈邦国,张晓明,等.电针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织bFGF､ES表达的影响[J].光明中医,2012,27(5):879-881.

[33]尤艳利,徐晓明,舒适,等.电针水沟穴对MCAO模型大鼠缺血半暗带VEGF及arresten表达的影响[J].上海中医药大学学报,2014,28(6):80-84.

[34]刘艳,柳刚.柳刚治疗后循环缺血性眩晕经验[J].湖南中医杂志,2022,38(8):48-50.

[35]秦彦强,孙忠人,魏庆双,等.针刺风池穴预处理对脑梗死大鼠的缺血耐受现象研究[J].针灸临床杂志,2015,31(9):65-68.

基金资助:安徽省高校自然科学研究项目(2023AH050760);全国中医药创新骨干人才培养项目(皖卫中医药发﹝2019﹞12号);安徽省重大疑难疾病中西医协同攻关项目(皖中医药发展秘﹝2021﹞70号);杨骏全国名老中医专家传承工作室项目(国中医药人教发﹝2016﹞42号)~~;

文章来源:杨丽芳,文林月,欧小燕,等.颈椎横突尖电项针法调控后循环缺血大鼠血管和神经新生[J].浙江中医药大学学报,2024,48(04):398-406.