慢性牙周炎(chronic paradentitis,CP)是一种伴有牙槽骨破坏的炎症性疾病。巨噬细胞可分为经典活化的巨噬细胞(M1巨噬细胞)和选择性活化(M2巨噬细胞),具M1/M2比值的失调可能是许多炎症性疾病(如动脉粥样硬化、肥胖、纤维化等)发病机制中的一个重要标志[1,2,3]。有关M1/M2平衡极化状态在牙周和种植体周围炎(peri-implantitis,PI)组织中的变化水平,可以反映疾病炎性程度的指标,均有可能成为CP和PI的反映指标,因此,从病变周围组织中寻找CP和PI发生、发展的标志物备受国内外学者青睐。有研究对CP患者巨噬细胞表型和相关炎症因子进行分析,结果表明巨噬细胞极化状态与CP密切相关,炎性M1巨噬细胞数目与种植周围炎的发生、发展具有正相关性[4,5,6,7]。国外已有研究表明M1巨噬细胞在具有炎症的种植体周围软组织中的表达具有统计学意义,但是对CP与PI二者之间M1/M2极化的关系,目前尚未见报道。

资料和方法

1、病例选择

收集广州医科大学附属第二医院,重庆医科大学附属口腔医院,中国科学院大学深圳医院三家医院口腔颌面外科手术患者牙周组织样本74例,24例诊断为CP患者牙周组织和28例诊断为PI患者牙周组织,另选取22例因正畸治疗需要拔除健康牙齿的健康牙周组织作为对照组(NC组),年龄31～63岁。纳入标准:①CP组需满足CP的诊断标准,且未接受系统性牙周治疗;②PI组需满足PI的诊断标准;③NC组无临床牙周炎症状;④各组均无影像学牙槽骨吸收现象;⑤口腔内天然牙不少于18颗;⑥患者具有较好的依从性;均行研究前沟通,根据自身意愿和实际病情接受治疗方式,并签署知情同意书。排除标准:①存在其他原因影响牙周健康的病变;②存在神经系统并发症、精神疾病或恶性肿瘤者;③拒绝或中途主动退出或失访者;④因自身认知能力差、免疫能力差等原因而无法耐受研究。所有参与者均有完整的病史和牙科病史。本研究经本院伦理委员会批准进行。

2、主要试剂及仪器

荧光定量PCR使用的10×buffer、dNTP mixture、Evagreen、Taq酶等购自TaKaRa公司(日本);过氧化氢、水饱和酚以及所有PCR引物购自生工生物工程(中国)股份有限公司;-80℃超低温冰箱(SANYO公司,日本);荧光定量PCR仪(ABI公司,美国);正置荧光显微镜(TE2000-U)(Nikon公司,日本);RM2235石蜡切片机(Leica公司,德国);微量移液枪(Eppendorf公司,德国);酶标仪及低温高速离心机(Thermo Scientific公司,美国);超纯水仪(Millipore公司,美国);其他常规化学试剂(南京晚晴化玻仪器有限公司,中国)。

3、牙周组织的获取

CP组来源于因严重牙周组织破坏而拔除牙的牙周组织;PI组来源于因严重牙周组织破坏而拔除种植体周围的牙周组织;NC组来源于健康牙周组织。所有样本大小相同,一半的切除样本提取总RNA进行qRT-PCR分析,其余进行免疫组织化学检查。

4、免疫组织化学染色

通过石蜡包埋及切片,免疫组化等评估牙周组织巨噬细胞表达情况;通过免疫组化对组织中F4/80阳性细胞的含量进行分析。对3组牙周组织进行石蜡包埋及切片,脱蜡水化后置入柠檬酸钠抗原修复液中,100℃沸水浴修复15 min。待切片在室温中自然冷却后用PBS液洗5 min×3次。将切片放入3% H2O2溶液中,室温孵育10 min,以阻断内源性过氧化物酶的活性,然后用PBS液洗5 min×3次。宣纸吸去组织周围水份,组织上滴加5%的四环素(Tetracycline)偶联牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭液,室温封闭1 h,抑制非特异性蛋白结合。吸去封闭液,在载玻片的组织上加入一抗,注意覆盖组织即可,置于湿盒中4℃孵育过夜。使用PBS液洗5 min×3次后,加入偶联辣根过氧化物酶的兔鼠通用IgG,于37℃孵育1 h;PBS液洗5 min×3次后,取1 mL蒸馏水,加3,3’-二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)显色试剂盒中A、B、C溶液各1滴,混匀后滴加到组织上,阳性信号显示棕色。显微镜下实时观察显色反应,待信号明显时立刻使用PBS清洗停止显色反应,防止显色过度。为定位细胞核位置使用苏木精复染,将PBS液清洗后的切片置于苏木精染色液中染色10～30 s,自来水冲洗约4～5次至水无色,最后脱水,中性树胶封片,并在显微镜下放大200倍观察拍照。

5、组织RNA的提取及qRT-PCR

5.1组织RNA提取

取前述方法获取的牙周组织样本,称取0.05 g组织至1.5 mL无酶EP管,加1 mL Trizol和适量钢珠后经超声研磨机研磨,无酶吸头吹打并转移至1.5 mL无酶EP管。Trizol处理的组织室温放置5 min,使其充分裂解。按200μL/mL加入氯仿,上下颠倒混匀,静置5 min后,4℃12 000 r/min离心5 min。吸取上层水相,至另一1.5 mL无酶EP离心管中,加入等体积的氯仿-酚混合物(1:1),摇匀,静置5 min,4℃12 000 r/min离心5 min。将上层水相转移至另一离心管中,加入等体积提前预冷的异丙醇,混匀,-20℃冰箱放置30 min。4℃12 000 r/min离心30 min,RNA沉于管底。弃上清,用100μL 75%的乙醇洗涤1次,4℃12 000 r/min离心5 min。将上清彻底吸净,室温晾干或真空干燥5～10 min。切勿使RNA样品完全干燥,否则很难溶解。最后,根据RNA的产量加入30～50μL焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水溶解RNA样品。利用分光光度计测定RNA于260 nm波长的OD值,并换算为浓度;稀释备用。

5.2 qRT-PCR相关基因mRNA检测

基因逆转录使用PrimeScriptTM RT Master Mix逆转录试剂盒(TaKaRa公司,日本)将mRNA逆转成cDNA,逆转录条件为:37℃15 min,85℃5 s,4℃保持。然后将逆转好的cDNA按照qRT-PCR体系进行检测。10×Taq酶Buffer 2μL,dNTP mixture(2.5 mmol/L)1.6μL,MgCl2 1.2μL,Evagreen 1μL,引物(10μmol/L 1:1)0.5μL,cDNA 1μL,Taq酶0.3μL,ddH2O 12.4μL。qRT-PCR反应条件:95℃5 min;95℃15 s,60℃30 s,72℃45 s;重复40个循环。以β-actin作为内参,相关基因引物序列见表1。

表1引物序列

6、统计学方法

使用SPSS 26.0软件进行统计分析,计量资料采用(x¯±s)表示,多组间的比较采用单因素方差分析(F检验),进一步两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1、牙周组织样本及巨噬细胞表达的比较

对比分析各组组织的牙周组织样本及巨噬细胞表达,结果表明:CP及PI组染色均可见上皮钉突异常生长及增生,炎性细胞大量聚集;NC组可见形态正常的上皮钉突并向结缔组织生长(图1)。

图1牙周组织切片镜下观察(HE染色,×200)

2 、M1、M2型巨噬细胞表达的比较

3组均可检出M1型巨噬细胞,且由多至少依次为CP、PI组及NC组。3组均可检出M2型巨噬细胞,且由多至少依次为PI、CP组及NC组。CP组的M1/M2比值明显高于其余两组(P<0.05),而PI组与NC组M1/M2比值差异较小(P>0.05)(图2)。

图2 M1、M2型巨噬细胞表达的比较

3、 M1、M2型巨噬细胞相关细胞因子表达的比较

3组均可广泛检出M1、M2型巨噬细胞相关细胞因子的表达,主要分布部位均为牙龈结缔组织。M1型巨噬细胞相关细胞因子的表达,CP组IFN-γ、IL-6表达水平明显高于其余两组(P<0.05),PI组IL-6表达水平明显低于NC组,而PI组与NC组IFN-γ表达水平差异较小(P>0.05)。CP组及PI组TNF-α、IL-12的表达水平明显高于NC组(P<0.05),而CP组及PI组TNF-α、IL-12的表达水平差异较小(P>0.05)(图3)。M2型巨噬细胞相关细胞因子的表达,NC组IL-4表达水平明显高于其余两组(P<0.05),而CP组及PI组IL-4表达水平差异较小(P>0.05)。3组间IL-10表达水平差异较小(P>0.05)(图4)。

图3 M1型巨噬细胞相关细胞因子表达

图4 M2型巨噬细胞相关细胞因子表达

讨 论

巨噬细胞是最重要的免疫和炎症细胞之一,在抗牙周病原体反应、CP及PI中发挥重要作用[8]。M1巨噬细胞是能够促进炎症反应的杀伤型巨噬细胞,M2巨噬细胞是能够正常修复的治愈型巨噬细胞。M1/M2型反应失衡导致多种疾病的发生发展,如动脉粥样硬化、肥胖等。最近的一项研究[6]利用多种表型标记研究巨噬细胞体内和体外变化,在小鼠CP牙龈和骨髓来源的巨噬细胞中均发现M1/M2比值增强,表明CP中M2向M1极化的表型转换。另一项动物研究也发现[3],流式细胞仪检测CP患者牙龈M1/M2比值增加。CP产生促炎细胞因子,表明在牙周组织损伤中巨噬细胞扮演重要角色。PI也会影响骨整合种植体周围的支撑骨[9]。尽管人们普遍接受和重视这类口腔病症,相关诊断标准仍不十分明确。既往研究表明,与促炎细胞因子相比,抗炎细胞因子IL-10的水平低得多,提示巨噬细胞效应表型类似于M1促炎亚群[10]。相反,在非感染的稳态口腔黏膜组织中,细胞因子效应表型类似于M2抗炎亚群[11]。因此,巨噬细胞细胞因子谱提示M1亚群与促炎病理有关,而M2巨噬细胞与体内平衡状态有关。

本研究中,3组组织均可检出M1型巨噬细胞,且由多至少依次为CP、PI组及NC组。3组均可检出M2型巨噬细胞,且由多至少依次为PI组、CP组及NC组。CP组M1/M2比值明显高于其余两组(P<0.05),而PI组与NC组M1/M2比值差异较小(P>0.05)。M1/M2比值结果与Khumaedi等[12]研究结果一致,因此,CP患者牙周组织免疫反应中以M1型巨噬细胞为主。分析原因在于[13]:①M1型巨噬细胞的作用在于启动体内体液免疫,摄取并杀伤牙周组织的致病菌;②M1型巨噬细胞可通过多种炎性细胞因子参与细胞免疫,并有效促进机体的继发性免疫应答,扩充组织免疫作用的范围及时程;③M2型巨噬细胞的作用在于吸收并消化免疫应答中的炎性因子及细胞,促进炎症反应的弱化及消除;还可通过分泌生长因子以促进免疫反应后牙周组织的恢复及愈合。当M1/M2关系中以M1型巨噬细胞为主导时,则牙周部位的免疫反应处于增强过程,生成较多炎性产物;而处于劣势的M2型巨噬细胞无法及时清理炎性产物,无法及时对免疫反应进行负性调节,引发牙周组织的免疫性损伤[14]。PI患者M1/M2比值与NC组差异较小,而PI组中个体差异较大,分析原因可能在于PI的治疗阶段不同,治疗后期可较好地恢复牙周健康;但部分PI炎症迁延难愈,长期进展可引发M1/M2比值异常[15]。因此,不同患者存在不同转归,M1/M2表达平衡的PI患者转归健康具有更高的可能性。

越来越多研究表明,活化巨噬细胞在口腔病变区域聚集并极化,导致牙周病的发生发展[16]。它们不同的表型可以被认为是一个从促炎M1到抗炎M2的变化。巨噬细胞亚群的相对失衡可能会影响疾病,加重口腔炎症性疾病,而M2亚群的优势有利于疾病的缓解[17]。此后,如果感染被免疫反应控制,牙龈炎仍然存在;否则,活化的巨噬细胞将继续分泌细胞因子并转移到M1巨噬细胞,表现出慢性炎症反应[18]。因此,巨噬细胞免疫防御功能和免疫调节功能的平衡对牙周组织的炎症进程至关重要。

本研究中,3组均可广泛检出M1、M2型巨噬细胞相关细胞因子的表达,主要分布部位均为牙龈结缔组织。M1型巨噬细胞相关细胞因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-12等。与既往研究结果保持一致,提示在CP及PI发病过程中炎性细胞因子存在较好的促进作用。TNF-α、IL-12的在3组表达趋势存在一致性,因此可能存在协同效应[19]。IFN-γ在PI组与NC组差异较小,与前述“PI患者的M1/M2比值与NC组差异较小”趋势保持一致,提示IFN-γ的作用在于促进巨噬细胞平衡向M1趋势极化。M2型巨噬细胞相关细胞因子包括IL-4、IL-10等。IL-4是目前研究较多的抗炎细胞因子,其表达水平与前述M2型巨噬细胞的表达趋势存在一致性,分析原因IL-4作用在于促进巨噬细胞平衡向M2趋势极化[20]。IL-10的主要作用在于降低炎症反应程度,促使牙周组织的愈合,但IL-10在3组中表达差异较小,分析原因IL-10与炎症治疗相关性较小,在健康的牙周组织亦广泛存在。

综上所述,牙周是一个复杂的生物环境,不仅起着物理屏障作用,而且在宿主先天防御系统中起重要作用。M1/M2巨噬细胞在CP患者表达明显高于PI及IH,因此M1/M2比值失衡可能较大程度地影响CP患者的发病,巨噬细胞表型极化的方向可能影响CP的发展过程;M1/M2巨噬细胞在PI患者中表达存在组内个体差异,因此PI的转归具有双向性。M1型相关细胞因子具有促炎作用,可通过诱导巨噬细胞极化方向促进CP的发病;M2型相关细胞因子具有抗炎作用,可通过干预巨噬细胞表型极化方向以影响CP发病进程。因此,巨噬细胞数目和极化状态与CP的关系密切,可导致牙周组织的破坏;极化程度有可能成为CP早期临床诊断的有效指标。

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基金:广东省省级科技计划项目(2014A020212509)