新兴的生物工程支架因其可设计的结构，能更好地模拟原始骨环境而成为组织工程中重要的部分[1]。其中，纳米纤维可模仿原生骨的胶原纤维，模拟天然细胞外基质[2],为细胞提供生长环境，促进干细胞粘附[3]、增殖和分化[4],从而促进骨再生。而静电纺丝是制备纳米纤维最行之有效的技术[5],且静电纺丝技术本身操作简单、经济实惠，因此具有独特的优势[6]。Sadek等[7]利用静电纺丝所制备的聚己内酯支架体外研究表明，可有效提高成骨细胞增殖和粘附从而促进骨再生。然而静电纺丝技术所制备的纳米纤维膜厚度较薄，结构趋于二维。即便是延长电纺时间，纳米纤维间也会出现分层现象。此外，纳米纤维膜内部孔径小、细胞浸润性也相对较差[8],缺乏孔隙通道的连接，导致出现细胞死腔[9],细胞实际只能在二维表面生长而非真正的三维立体环境[10]。

因此，Gungor-Ozkerim等[11]采用物理集成的方法将明胶微球加载在纳米膜夹层间，改善纳米膜的空间结构。这种做法虽然增强了纳米支架的立体结构，但操作复杂且支架会出现分层现象。近年来，与静电纺丝技术原理相似的静电喷雾技术逐渐进入大家的视野，通过高电势差将液体分散成极小的液滴，随着溶液的挥发在接收板上形成聚合物涂层或纳米颗粒[12]。

为解决静电纺丝支架立体结构的问题，本课题组拟采用电喷电纺交替进行的方法制备的改良纳米纤维支架，在保留纳米纤维原有优势的同时，有效改善传统电纺技术立体结构的不足，制备出具有多孔结构的立体纳米纤维支架，可有利于细胞向内部生长，从而促进骨修复。

1、材料与方法

1.1 仪器和试剂

仪器：水浴加热磁力搅拌器(上海力辰仪器科技有限公司，DF-101S);水纯化和超纯水系统(美国Millipore公司，RiOs8);生物材料静电纺丝机(佛山轻子精密测控技术有限公司，TEADFS-700);场发射扫描电子显微镜(德国卡尔蔡司公司，Gemini SEM 300);激光扫描共聚焦显微镜(德国卡尔蔡司公司，LSM880);正置荧光显微镜(德国徕卡公司，DM6 B)。试剂：聚己内酯(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，24980-41-4);六氟异丙醇(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，920-66-1);4%多聚甲醛(白鲨生物科技有限公司，BL539A);DMEM低糖培养基(Gibco公司，C11885500BT);胎牛血清(美国英克公司，A6907FBS);1%青霉素-链霉素(碧云天生物技术有限公司，C0222);Calcein AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司，C2015L);抗荧光淬灭封片液 (含DAPI)(碧云天生物技术有限公司，P0131);碱性磷酸酶检测试剂盒(上海碧云天，P0321S);茜素红S染液(武汉赛维尔，G1038);骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)(爱博泰克生物有限公司，A0231);Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ, COL-1)(爱博泰克生物有限公司，A1352)。

1.2 实验方法

1.2.1 制备纳米纤维支架

分别制备浓度为10%和4%的聚己内酯(polycaprolactone, PCL)的六氟异丙醇溶液用于静电纺丝和静电喷雾。电纺参数：电压22 kV、流速1 mL/h, 接收距离26 cm, 电喷参数：电压14 kV、流速1 mL/h, 接收距离26 cm。电纺3 h后电喷0.5 h, 如此循环，得到3次电纺和2次电喷后的改良纳米纤维支架PCL NFs + PCL MSs。电纺10.5 h制备传统纳米纤维支架PCL NFs作为对照组。将制备好的支架材料置于真空干燥箱干燥过夜。

1.2.2 纳米纤维支架的形貌评估

将两组支架裁剪成4 mm×4 mm的正方形样品，利用离子溅射仪表面喷金后使用扫描电子显微镜观察支架表面形貌。此外，分别将两种支架放置于液氮中淬断，获取截面，喷金后使用扫描电子显微镜观察支架截面形貌。

1.2.3 纳米纤维支架的机械性能检测

使用具有10 N传感器并以5 mm/min的速度移动的万能试验机来检测1 cm×3 cm(长度和宽度)的两组支架的拉伸力学性能。

1.2.4 细胞接种

参考文献[13]方法提取大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow mesenchymal stem cells, rBMSCs)。将各组支架裁剪成直径适合培养孔板的圆片，环氧乙烷灭菌后，PBS洗涤并置于孔板底部。将第3代rBMSCs均匀接种在无菌支架表面，使用DMEM低糖培养基(含10%胎牛血清)进行细胞培养。

1.2.5 活/死细胞染色

细胞培养3 d后，取出支架材料，用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒对支架上的细胞进行染色，40 min后用PBS充分洗涤。在正置荧光显微镜下观察，活细胞显示绿色荧光，而死细胞显示红色荧光。

1.2.6 细胞骨架染色

细胞培养3 d后，参考文献[14]方法，对支架上细胞进行细胞骨架染色，利用正置荧光显微镜观察细胞形态。此外，细胞培养5 d后，进行细胞骨架染色，采用激光共聚焦显微镜观察rBMSCs向支架内部浸润情况。

1.2.7 扫描电镜观察细胞粘附

细胞培养3 d后，取出支架材料，4%多聚甲醛固定15 min, PBS洗涤，乙醇梯度脱水。临界点干燥，喷金，并通过扫描电子显微镜观察rBMSCs在支架表面的粘附情况。

1.2.8 RT-qPCR

将rBMSCs接种在两组支架表面(方法同1.2.4),24h后按参考文献[14]方法进行成骨诱导。成骨诱导第7天，使用Trizol法收集各组支架材料上rBMSCs的总RNA。用PrimeScript RT Kit (中国Takara, RR047Q)逆转录成cDNA。采用PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit(中国Takara, RR055A)检测成骨相关基因COL1,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP),骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP2),骨特异性转录因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨桥蛋白(osteopontin, OPN)的mRNA表达。相关引物序列如表1,以没有支架材料组作为空白对照，采用2-ΔΔCt法计算各mRNA相对表达量。

1.2.9 免疫荧光染色

成骨诱导第7天，进行成骨相关标志蛋白COL1和BMP2的免疫荧光染色。首先，用PBS轻轻洗涤接种细胞的支架，然后用多聚甲醛固定，PBS洗涤，并用0.1%Triton X-100处理15 min进行细胞膜通透。37 ℃ BSA抗原封闭1 h、加入一抗(COL1,ABclonal, A1352,1∶200;BMP2,ABclonal, A0231,1∶200)在4 ℃过夜。之后，将一抗洗涤并浸入相应的二抗中。仔细洗涤后，用DAPI对样品进行染色，并使用正置荧光显微镜进行观察。

表1引物序列

1.2.10 ALP染色和茜素红染色

在诱导第7天进行ALP染色检测ALP活性，在诱导第14天行茜素红染色观察矿化钙结节的形成。具体染色方法根据试剂厂家指导进行。

1.2.11 小动物CT扫描(Micro-CT)

经安徽医科大学动物保护和使用委员会批准(批号：20201005)和监督，参考文献[15]方法进行大鼠颅骨骨缺损造模，分组设置如下：(1) 空白组；(2)PCL NFs; (3)PCL NFs+ PCL MSs。每组样本量为5。分别在植入4周和8周后取样进行Micro-CT扫描，使用Skyscan NRecon v.1.6.6软件进行重构，然后通过Skyscan CTvol v.2.2.3.0和Skyscan CT an v.1.15.4.0软件进行新生骨组织形态观察，以及骨密度(bone mineral density, BMD)、骨体积/组织体积(bone volume/tissue volume, BV/TV)以及骨小梁厚度(trabecular thickness, Tb.Th)分析。

1.2.12 统计学分析

本实验所有数据均经过3次重复验证所得，以

来表示。采用独立样本t检验分析组间差异，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 纳米纤维支架的形貌

电镜图片显示(图1a,1b),PCL NFs+PCL MSs中电喷纳米微球大小相似，且可以均匀分布在纳米纤维上，两组支架的平面与截面的电镜图像(图1c～1f)可见，两种纤维支架表面纤维形态连续光滑，纤维直径均匀。PCL NFs截面厚度为53.59μm,PCL NFs+PCL MSs截面厚度为231.1μm,约为PCL NFs的4倍。

2.2 纳米纤维支架机械性能检测

机械性能检测结果如图2所示，PCL NFs拉伸应力为(2.14±0.36)MPa,而PCL NFs+PCL MSs拉伸应力为(2.78±0.53)MPa,与PCL NFs相比约提高了30%。

2.3 rBMSCs在纳米纤维支架上生长和浸润情况

图1纳米纤维支架形貌图

从活/死细胞染色图像(图3a, 3b)中可看出，两组支架上的细胞几乎均为发出绿色荧光的活细胞，但PCL NFs + PCL MSs表面细胞数量多于PCL NFs。细胞骨架染色结果(图3c, 3d)显示两组支架上的rBMSCs均呈现出多角形态，细胞核和细胞骨架清晰可见。而电镜图像(图3e, 3f)显示，相较于PCL NFs, PCL NFs+PCL MSs表面的rBMSCs铺展更加充分，显示出更多的伪足和胞间连接，提示更好的细胞状态，并且细胞数量较多。此外，从细胞在两组支架内部的三维分布(图3g, 3h)情况来看，PCL NFs上细胞基本都分布在支架表面，而PCL NFs+ PCL MSs表面的细胞有不同程度的向内部生长，提示更好的细胞浸润效果。

图2PCL NFs和PCL NFs+PCL MSs的应力-应变曲线

2.4 纳米纤维支架的体外促成骨分化能力

RT-qPCR结果(表2)表明，成骨诱导第7天，相较于PCL NFs, PCL NFs + PCL MSs组rBMSCs的成骨相关基因(BMP2、ALP、COL1、RUNX2、OPN)表达显著上调，尤其是早期相关基因COL1、ALP和BMP2的表达均上调2倍左右。ALP染色(图4a)提示在成骨诱导第7天时，PCL NFs+ PCL MSs组rBMSCs的ALP活性明显高于PCL NFs组，结果与RT-qPCR相一致。茜素红染色结果(图4b)则表明PCL NFs+PCL MSs组具多的矿化结节，提示出该支架更好地促进rBMSCs成骨分化的效果。细胞免疫荧光染色结果(图5)在蛋白水平证实了 PCL NFs + PCL MSs组rBMSCs的成骨相关标志物COL1和BMP2明显升高的表达量。

图3纳米纤维支架生物相容性

图4纳米纤维支架体外成骨分化性能

表2成骨诱导7 d后的 BMP2、ALP、COL1、RUNX2、OPN基因水平检测

图5两组支架细胞成骨诱导7 d后COL1(5a)和BMP2(5b)表达的免疫荧光染色图(×20)

2.5 纳米纤维支架的体内骨修复性能

图6展示了两组支架在大鼠体内修复4周和8周的Micro CT冠状面和矢状面图。可以看出，4周和8周时空白对照组几乎没有新骨生成，PCL NFs组仅有缺损处周围有少量骨生成而PCL NFs+ PCL MSs组有较多且连续的新生骨。对BMD、BV/TV以及Tb.Th进行定量分析(表3),结果与重构CT图像基本一致。尤其在术后4周时，PCL NFs + PCL MSs组的BMD、BV/TV及Tb.Th均可达到对照组和PCL NFs组的两倍左右。

图6空白组、PCL NFs 支架组与PCL NFs + PCL MSs 支架组大鼠术后4周和8周Micro CT图像

表3骨缺损部位Micro CT各参数之间统计学分析

3、讨论

本实验通过静电纺丝与静电喷雾交替进行的方法制备了三维立体纳米支架，电镜及机械性能结果表明所制备的PCL NFs + PCL MSs表面形貌良好，截面没有出现分层现象，且由于纳米微球的原因，其厚度明显增加，克服了传统纳米纤维膜缺乏立体结构的缺点，且增强了纳米支架的机械性能，更好地还原了原生骨立体结构，有效模仿天然骨细胞外基质[10]。这可能是由于微球的体积较大，导致其与纳米纤维有更大的接触面积，在进行拉伸试验的时候，能够更好地分散来自周围纳米纤维的应力。后从活/死细胞染色、细胞骨架染色、细胞电镜以及支架内部生长等实验结果可看出，PCL NFs + PCL MS生物相容性良好，细胞可在支架表面生长。且PCL NFs + PCL MS表面细胞增殖及粘附明显好于PCL NFs。这是因为PCL NFs的二维结构限制了细胞浸润[16],细胞只能在支架浅表层生长[17]。而PCL NFs + PCL MSs的三维立体结构有利于气液交换和营养运输[18],有效促进细胞在支架表面及内部增殖，更好地促进骨再生。

此外，经体外成骨诱导，PCL NFs + PCL MSs组ALP染色以及茜素红染色明显好于PCL NFs组，这可能是因为由于支架的立体结构， 导致细胞形态拉伸，从而调节了细胞骨架形态，导致层粘连蛋白-A表达增加[19,20],并提高成骨能力。这也充分表明具有立体结构的支架可以更好地诱导成骨分化。且进一步从成骨机制及蛋白水平检测结果可看出，PCL NFs + PCL MSs组通过刺激成骨相关基因(BMP2、ALP、COL1、RUNX2、OPN)的表达上调及蛋白(COL1和BMP2)的表达，从而促进骨再生。

从支架在大鼠体内成骨结果可看出，PCL NFs虽有一定的成骨能力，但由于支架结构限制，新生骨仅能在支架周围生长。与之相比，PCL NFs + PCL MSs由于其良好的立体结构，营养可以很好的在支架内部运输，有较好的成骨效果。

综上所述，本研究成功制备了具有立体结构的改良纳米纤维支架，有效改善了传统静电纺丝制备的纳米纤维支架缺乏立体结构的缺点，更好地模拟了原生骨的结构，提高了骨修复效果。此外，该改良纳米纤维支架制备方法还可以作为良好的药物缓释体系。由于微球体积较大，同轴静电喷雾的包封效果明显由于同轴静电纺丝。且此方法制备过程简便，可用范围变广，因此具有良好的临床应用前景。

基金资助:国家自然科学基金青年项目(编号:82201034);安徽省自然科学基金青年项目(编号:2108085QH334);安徽医科大学基础与临床合作研究提升计划(编号:2022xkjT017);

文章来源:管欣悦,刘愈晖,安欣,等.改良静电纺丝立体纳米纤维支架用于骨修复的研究[J].口腔医学研究,2024,40(11):985-991.