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口腔鳞癌-血管内皮细胞自发融合受下调miR-181a-5p的影响研究

2020-08-20 283 上传者：管理员

摘要：目的:探讨miR-181a-5p对口腔癌细胞系CAL-27与人系带血管内皮细胞(HUVEC)之间融合的影响。方法:通过对CAL-27和HUVEC进行稳定转染绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白,证实CAL-27和HUVEC有自发融合的现象存在,并通过实时定量PCR检测HUVEC内miR-181a-5p的表达,通过瞬时转染HUVECmiR-181a-5pinhibitor后检测miR-181a-5p的表达情况;并通过人工计数和流式细胞术分析融合情况。结果:CAL-27能与HUVEC发生融合。通过降低miR-181a的表达,发现CAL-27与HUVEC的融合率升高(P<0.05)。结论:miR-181a-5p与细胞融合相关,降低miR-181a-5p表达能增加CAL-27与HUVEC融合的发生。

关键词：
miR-181a-5p
侵袭
免疫监视
口腔癌
细胞融合
肿瘤
转移
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口腔癌在世界全身恶性肿瘤中排名第六位,不同国家不同地区其发病率有明显的区别。在我国发病率相对较低,位于第十位,但是口腔癌发病率逐年增加,再加上我国人口基数较大,口腔癌的患者人数较多,特别是舌癌、颊癌早期就可发生淋巴结转移,因此口腔癌越来越受到临床医生的重视。

microRNA是一类内生的、长度约22个核苷酸的非编码小RNA,通过与靶基因mRNA的3’UTR区域结合而在转录后水平调控靶基因的表达。异常表达的miRNA通过调控mRNA的转录、信号通路网从而影响生物学的诸多功能。包括肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、凋亡和生存。其中,miR-181家族成员miR-181a-5p在肿瘤的发生发展和分化过程中发挥着重要作用[1]。

细胞融合,也称之为细胞杂交,由两个细胞融合成为一个细胞的过程。在这个过程中,除了细胞膜发生融合外,细胞核也发生了融合。有学者研究,融合后的杂交细胞具有双母代的表型[2]。细胞融合的发生对肿瘤的侵袭、转移以及在逃避免疫监视中起到重要作用[3]。

细胞融合和miR-181a-5p在肿瘤的发生发展过程中,两者都能对肿瘤的增殖、侵袭、转移中都发挥重要作用,那么两者之间是否存在相关性?因此本文通过研究miR-181a-5p对HUVEC的影响,发现HUVEC和CAL-27的融合发生改变,表明降低miR-181a-5p表达能够降低细胞融合的发生。

1、材料与方法

1.1试剂

Trizol试剂(美国Invitrogen公司);反转录试剂盒(日本TaKaRa公司);Real-timePCR(日本TaKaRa公司);Real-timePCR检测仪(美国Bio-Rad公司);miR-181a-5p引物(39-AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU-61)由广州锐博生物科技有限公司合成;高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司);胎牛血清(杭州四季青);Lipo6000促转染试剂(中国碧云天公司);OPTI-MEM(美国Gibco公司);miR-181a-5pinhibitor及Negativecontrol(NC,上海吉玛公司)。

1.2细胞培养及共培养

CAL-27为本实验室长期保存,采用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清)。HUVEC为ATCC购买,并获赠于武汉大学赵怡芳教授实验组,采用EGM-2完全培养基。两者细胞都处于37℃、5%CO2培养箱中培养,每天观察并更换细胞培养液1次,待细胞长满约80%时,用胰蛋白酶消化传代,取生长状态良好的对数生长期细胞用于实验。共培养体系为RFP-CAL-27和GFP-HUVEC以1∶1的状态下培养,培养3d,在显微镜下观察融合细胞并人工计数。

1.3细胞转染

细胞慢病毒稳定转染荧光蛋白,将CAL-27和HUVEC分别转染GFP和RFP,转染后使用10mg/L嘌呤霉素筛选,留取稳定转染的细胞,通过流式分选获取高转染率的细胞群,得到稳定转染红色荧光的CAL-27(RFP-CAL-27)和稳定转染绿色荧光的HUVEC(GFP-HUVEC)。将对数生长期HUVEC细胞接种于6孔板,按照实验设计分组,实验组(转染miR-181ainhibitor)、阴性对照组(转染negativecontrol)和空白对照组(只加转染试剂)。按照Lipo-6000的说明书转染miR-181a-5pinhibitor和negativecontrol。48h后Real-timePCR检测miR-181a-5p的表达情况。实验重复3次。

1.4总RNA提取及Real-timePCR

用Trizol试剂按照操作说明书,分别提取实验组阴性对照组以及空白对照组的总RNA,各取2μgRNA反转录成cDNA,行Real-timePCR。反应条件:95℃预变性30s;然后按95℃5s,60℃30s,进行40个循环。以每个样本的U6作为内参,基因相对表达量采用2-△△Ct方法进行计算分析。实验重复3次。

1.5显微镜观察和流式细胞检测

以1∶1接种RFP-CAL-27和GFP-HUVEC于共聚焦专用观察皿,共培养72h,PBS冲洗2次,后在共聚焦显微镜下观察。24孔板观察RFP-CAL-27和GFP-HUVEC,共培养72h,在100倍显微镜下随机6个独立视野观察,融合细胞取总和。观察均由两位实验者分别检测,取其平均值,实验重复3次。25cm2的培养瓶细胞,PBS冲洗3次,胰酶将细胞完全消化后,离心1000r/min5min取沉淀,PBS重悬,离心1000r/min5min,2次后,流式细胞仪检测。实验重复3次。

1.6统计学方法

采用SPSS18.0统计学分析软件,实验数据以x¯±s表示,两组间比较采用两样本t检验。

2、实验结果

2.1CAL-27和HUVEC融合的鉴定

通过对CAL-27转染红色荧光(RFP-CAL-27)和HUVEC转染绿色荧光蛋白(GFP-HUVEC)在100倍镜下,融合细胞呈橙色,并在显微镜下,可以观察红色和绿色荧光(图1)。

2.2转染48h后miR-181a-5p的表达变化

通过Real-timePCR检测miR-181a-5p的表达,结果采用两样本t检验,提示转染miR-181a-5p的转染组的miR-181a-5p的表达较空白对照组显著下调,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3人工计数融合细胞

对转染后GFP-HUVECinhibitor和inhibitorNC之后48h,与RFP-CAL-27细胞数以1∶1共培养3d后,在100倍显微镜下随机6个独立视野观察,计数融合细胞取总和。空白对照组融合细胞数为(14.67±1.53)个,阴性对照组融合细胞数为(15.33±1.53)个,inhibitor转染组融合细胞数为(25.67±1.15)个。结果采用两样本的t检验,提示inhibitor转染组较空白对照组融合细胞数显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

图1CAL-27和HUVEC融合细胞的典型图像

2.4融合细胞的流式分析

inhibitor转染组[(1.62±0.04)%]较阴性对照组[(1.30±0.03)%]融合率显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组[(1.30±0.03)%]和空白对照组[(1.32±0.04)%]比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3、讨论

肿瘤微环境对肿瘤的增殖、转移发挥了重要作用,肿瘤微环境能改变周围的组织细胞的性状,从而影响肿瘤生长[4]。miR-181a是miR-181家族的一员,在全身的肿瘤功能研究相对较多,在口腔颌面部肿瘤的影响相对较少,而miR-181a对肿瘤的生长增殖分化,都具有重要影响。但是miR-181a对肿瘤的影响尚未明确,有研究提示miR-181a具有促癌作用[5,6],也有研究提示miR-181a具有抑癌作用[3]。在口腔颌面部肿瘤的腺样囊性癌中,高肺转移性的ACC-LM表达的miR-181a较ACC-83表达的miR-181a较低,说明miR-181a在ACC中,miR-181a成为一个影响预后的指标[7]。

细胞融合可以发生在生理及病理状态,这是一种能将两种亲代的性状转移至单一的子代细胞上的变化[8],细胞融合对肿瘤的侵袭和转移发挥了一定的作用。因此当CAL-27和HUVEC发生融合时,形成的融合细胞既有肿瘤细胞的特性、上皮特性,又具有了内皮细胞的特性[2]、间质细胞的特性,融合细胞就像肿瘤细胞发生EMT的特性[9],从而增强了肿瘤细胞的侵袭和转移[10]。肿瘤细胞的转移是一个十分复杂的过程,而在累及血管的时候,肿瘤细胞和内皮细胞融合形成的融合细胞可以破坏内皮结构的完整性,也为剩余肿瘤的转移提供了便利。

通过免疫荧光确认了CAL-27能与HUVEC发生融合,实验中发现通过转染miR-181a-5pinhibitor和miR-181a-5pNC后,发现HUVEC和CAL-27的融合率增加了。miR-181a-5p在腺样囊性癌中成为一个预后的指标,在肺高转移性腺样囊性癌中miR-181a-5p低表达[5]。所以可以认为miR-181a-5p是一个抑癌的指标,在实验中发现降低miR-181-5p的表达,HUVEC与CAL-27的融合率会降低。融合率的降低在一定的程度上抑制了肿瘤的侵袭和转移,和miR-181a-5p抑癌的表现相同。Cirilli等[11]也发现线粒体的老化,其miR-181a-5p的含量也发生了变化,随着线粒体老化,miR-181a-5的表达量增加。因此,抑制miR-181a-5p,在一定的程度上抑制了线粒体的老化,维持了细胞的活性,所以通过降低miR-181a-5p的含量,CAL-27和HUVEC的融合率可能发生降低。通过targetscan(www.targetscan.org)搜索预测发现,miR-181a-5p所对应靶基因较多,发现其中VCAM-1预测microRNA家族发现miR-181a-5p是其主要保留靶基因。在Song等[12]证实VCAM-1可以通过VLA/VCAM-1轴影响OSCC与HUVEC的融合。因此,降低miR-181a-5p可能通过减弱了对VCAM-1mRNA的影响,使VCAM-1的表达增加,因此CAL-27和HUVEC的融合率增加。

miR-181a-5p在口腔颌面部肿瘤的研究相对较少。口腔颌面部肿瘤类型较多,病理分型更多,同时miR-181a-5p可以影响肿瘤细胞和内皮细胞融合,因此,miR-181a-5p可以在肿瘤的预后方面作为一个参考。同时,细胞融合的研究相对较困难,自发融合率太低,但在大基数情况下,融合细胞的数目并不少,能起到的作用也不容忽视,因此,细胞融合特别在肿瘤的侵袭和转移方面的研究值得深入研究,本研究证明了miR-181a-5p对融合的影响,miR-181a-5p对融合的影响的信号通路细节仍值得深入研究。

参考文献：

[1]雷振伟,张瑜,张旭.miR-181a在人类恶性肿瘤中作用机制的研究进展[J].解放军医学院学报,2016,37(11):1204-1207.

[4]韩生伟,韩伟,胡勤刚.炎症､低氧与口腔肿瘤的发生发展[J].口腔医学研究,2014,30(10):1007-1009.

[7]何倩婷,陈丹,刘中华,等.miR-181a对唾液腺腺样囊性癌细胞株侵袭和迁移的影响[J].中华口腔医学研究杂志(电子版),2014,8(6):447-453.

黄春明,刘克.下调miR-181a-5p对口腔鳞癌-血管内皮细胞自发融合的影响[J].口腔医学研究,2020,36(08):757-760.

基金:国家自然科学基金青年项目(编号:81702104)