慢性肾病(chronic kidney disease, CKD)作为一种不可逆的结构性或功能性肾脏损害，已成为全球范围内危害健康的常见病。终末期肾病是慢性肾病发展的终末阶段，终末期肾病患者开通血透通路的首选方式为动静脉瘘(arteriovenous fistulas, AVF)。然而随着使用时间增长，AVF瘘口静脉端可能因血管新生内膜增生及血栓形成逐渐狭窄。近年来的报告显示，AVF的1年通畅率为60%,2年降到51%[1]。血管内皮细胞损伤引起的新生内膜增生和血栓形成，是导致血管狭窄的主要原因之一[2]。因此，预防新生内膜增生以提高AVF通畅率对患者至关重要。

舒洛地特(sulodexide, SDX)是从猪肠黏膜中提取的高度纯化的糖胺聚糖混合物，由80%的硫酸肝素和20%的硫酸皮肤素组成，具有抗血栓、抗炎、抑制细胞增殖等作用[3,4,5,6]。舒洛地特对血管具有保护作用，在临床上已被应用于糖尿病肾病、慢性动静脉疾病[5,6]的辅助治疗。然而，舒洛地特是否可用于阻止慢性肾病患者AVF新生内膜增生过程并不清楚。

YAP是Hippo信号通路的转录因子，Hippo通路通过调节细胞增殖、分化和迁移，在发育过程中控制器官大小和形态发生[7,8]。在动脉损伤模型中，YAP的异常调控能引起血管新生内膜增生和血管狭窄[9]。舒洛地特是否可通过调控YAP发挥作用也不清楚。作为安全有效的治疗药物，本研究希望了解舒洛地特是否可对CKD患者新生内膜增生发挥作用并探究其作用机制，为临床防治动静脉瘘术后血管狭窄提供新的治疗方案。

1、材料与方法

1.1 材料与试剂

本实验采用的材料与试剂有：舒洛地特(意大利Alfasigma公司);胎牛血清(FBS,美国Hyclone公司);青-链霉素(中国碧云天);苏木精-伊红染液(C0105S,中国碧云天);CCK-8(BG0025,中国葆光公司);一抗：YAP(BS9920m, 美国Bioworld公司);phosphor-YAP(BS94007,美国Bioworld公司);间充质细胞标志分子(connective tissue growth factor, CTGF,BS7445,美国Bioworld公司);CD31(BS7445,美国Bioworld公司)。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(A0208,中国碧云天);辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(A0216,中国碧云天);Cy3标记的山羊抗兔IgG(A0516,中国碧云天)。

1.2 实验动物与分组

成年雄性SD大鼠18只，体质量(300±50)g(陆军军医大学动物实验中心提供)。依据随机数字法将大鼠分为3组，每组6只。① AVF组，正常大鼠(Ctl)进行AVF手术；②慢性肾病组(CKD+AVF组):大鼠经诱导慢性肾病后进行AVF手术+与3组等体积生理盐水灌胃2月；③舒洛地特组(CKD+AVF+SDX组):大鼠经诱导慢性肾病后进行AVF手术+8 mg/(kg·d)SDX灌胃2月。CKD模型和AVF手术建立参考已有文献进行[10],通过对大鼠进行尾尖静脉采血检测血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和血清肌酐(serum creatinine, Cr)确认CKD模型建立成功后进行AVF手术。

1.3 样本的收集与固定

于AVF术后8周进行标本采集，整个过程在异氟醚麻醉下进行，麻醉成功后将大鼠以仰卧位固定，暴露颈部动静脉瘘并在两端结扎，取血管组织，完成采集。采集的血管用生理盐水冲洗管腔后置于4%多聚甲醛固定液中4 ℃过夜固定，经各级浓度的乙醇逐步脱水后放入二甲苯透明，再进行浸蜡、包埋和切片等操作。用于电镜观察的标本，在生理盐水冲洗后用2.5%戊二醛进行固定。

1.4 HE染色

石蜡切片经烤片、脱蜡、水合后用苏木精染色5 min, 蒸馏水洗涤3次后用伊红染色2 min, 再经脱水、透明，最后用中性树脂封片，在光学显微镜下观察。

1.5 免疫荧光

切片脱蜡、复水，在抗原修复液中100 ℃抗原修复10 min, 经1.5%H2O2和50%甲醇淬灭内源性过氧化物酶活性15 min, 0.3%Triton X-100/PBS通透20 min, 免疫染色封闭液封闭1 h, 4 ℃下滴加一抗孵育过夜，室温下孵育相应的二抗1 h, 然后滴加DAPI孵育5 min, 在荧光显微镜下观察拍照。

1.6 细胞培养和处理

内皮细胞株EAHy926(人脐静脉细胞融合细胞)购自美国细胞培养物收藏中心(American type culture collection, ATCC),用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素抗生素的DMEM培养基在37 ℃、5%CO2培养箱中传代培养，每48 h更换一次培养液。EAHy926接种且细胞融合70%左右，无血清处理后，按不同分组进行处理。细胞分组如下：①对照组(Ctl)、②CKD大鼠血清处理组(CKD serum)、③ CKD大鼠血清+舒洛地特处理组(CKD serum+SDX)、④CKD大鼠血清+维替泊芬处理组(CKD serum+VP)。对照组培养基中加入正常大鼠血清含量为10%,CKD大鼠血清处理组为培养基中加入CKD大鼠血清含量为10%,共处理组均先加入CKD大鼠血清1 h后再加入舒洛地特(2.5 μg/mL)或VP(0.25 μmol/L)[11],继续培养24 h。

1.7 细胞增殖检测

细胞以2 000/孔的密度接种于96孔板，分别给予不同浓度(0、2.5、5、10、20、40 μg/mL)舒洛地特处理24 h, 再以2.5 μg/mL浓度分别处理24、48和72 h, 每组设置3个复孔，同时设空白对照组。处理后加入10 μL 细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)试剂孵育2 h, 在酶标仪450 nm波长下测定各孔吸光度。细胞存活率=(实验组-空白组)/(对照组-空白对照组)×100%。

1.8 蛋白印迹检测

处理后的细胞用RIPA裂解液冰上裂解5 min, 刮取细胞裂解液于EP管中，4 ℃下以5 000× g离心5 min, 收集上清进行蛋白质浓度测定，然后加入上样缓冲液，100 ℃ 加热5 min后变性。在10% SDS-PAGE电泳凝胶的上样孔中加入20 μg样品，以70 V的恒压条件浓缩40 min, 120 V的恒压条件分离80 min后，转移到硝酸纤维素膜上，室温封闭1 h。进一步在4 ℃分别进行GAPDH(1∶3 000)、YAP(1∶1 000)、pYAP(1∶1 000)、CD31(1∶1 000)和CTGF(1∶1 000)一抗孵育过夜，用TBSTw(Tris-Buffered Saline Tween-20)洗膜5 min×3次，与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗(1∶3 000),室温孵育2 h, TBSTw洗膜5 min×3次。按ECL显影液说明书显影，放入化学发光仪中成像。

1.9 统计学分析

实验均重复至少3次，数据均以

表示。采用GraphPad Prism 8进行统计分析并制图，两组之间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CKD大鼠模型构建

为探讨SDX在CKD大鼠血管内膜增生中的作用，本研究首先对大鼠进行CKD造模。与未进行AVF手术前的正常对照(Ctl)组大鼠相比，CKD大鼠血清尿素氮和血清肌酐显著升高(P <0.05,图1),表明CKD大鼠建模成功。

图1 5/6肾切除术诱导慢性肾病后大鼠尿素氮(A)及肌酐(B)检测结果

2.2 舒洛地特抑制CKD大鼠AVF术后血管内膜增生

CKD建模成功后，对各组大鼠进行AVF手术，术后进行SDX灌胃，2个月后检测血管新生内膜厚度。HE染色结果显示CKD+AVF组血管新生内膜较AVF组明显增厚，管腔与内膜面积比降低(P<0.05);在SDX灌胃处理后，与CKD+AVF组相比，CKD+AVF+SDX组血管新生内膜增厚程度减轻，管腔与内膜面积比有明显提升(图2)。

2.3 舒洛地特抑制CKD诱导的YAP信号激活

为探讨SDX抑制新生内膜增殖是否与YAP有关，采用免疫荧光检测了CKD大鼠AVF术后静脉YAP及其下游靶分子CTGF的表达(图3)。与AVF组相比，CKD+AVF组大鼠AVF瘘口内膜和内皮细胞均表达YAP和CTGF,且内皮细胞中YAP和CTGF的荧光强度显著增强，而YAP磷酸化水平下调，即pYAP荧光强度降低。舒洛地特灌胃后，与CKD+AVF组相比，CKD+AVF+SDX处理组AVF瘘口YAP和CTGF的表达降低，YAP磷酸化水平明显升高。表明CKD通过降低YAP磷酸化水平激活YAP信号，引起了CTGF表达；而舒洛地特对YAP信号的激活起到阻止作用。

图2 CKD大鼠AVF术后新生内膜增生检测

图3 免疫荧光检测大鼠AVF瘘口YAP和CTGF的表达

2.4 舒洛地特影响EAHy926细胞存活率

为了进一步探讨舒洛地特的作用机制，本研究培养了人内皮细胞株EAHy926细胞，首先以不同浓度的SDX(0、2.5、5、10、20、40 μg/mL)处理细胞，检测细胞存活率。CCK-8检测结果显示，在SDX处理24 h后，随着SDX浓度的增加，细胞存活率逐渐降低。与0 μg/mL相比，舒洛地特浓度为2.5 μg/mL时，细胞存活率降到80%(P<0.05,图4A),在2.5～20 μg/mL浓度之间，细胞存活率无明显变化，直到40 μg/mL的浓度才出现明显抑制。进一步检测2.5 μg/mL SDX处理后24、48、72 h的细胞存活率，结果发现随SDX处理时间增加，EAHy926细胞存活率也随之降低。与0 h处理组相比，72 h组EAHy926细胞存活率受到显著抑制(P<0.05,图4B)。因此，为保证SDX处理效果，后续实验选择细胞存活率为80%时2.5 μg/mL舒洛地特处理24 h。

图4 舒洛地特对EAHy926的存活率的影响  

2.5 舒洛地特抑制CKD诱导的EAHy926细胞YAP信号激活

在体外细胞实验过程中，利用CKD大鼠血清处理内皮细胞。蛋白印迹结果表明，与用正常大鼠血清处理细胞(Ctl组)相比，CKD大鼠血清诱导了内皮细胞YAP和CTGF的表达，降低了YAP磷酸化水平(P<0.05,图5)。与CKD serum组相比，加入SDX处理后，CKD serum+SDX组内皮细胞YAP和CTGF的表达降低，YAP磷酸化水平明显升高(P <0.05,图5),与免疫荧光实验结果一致。本研究进一步在CKD大鼠血清处理基础上加入YAP信号阻断剂VP,与CKD serum组相比，VP处理后(CKD serum+VP组)中YAP表达显著降低，YAP磷酸化水平明显升高，CKD血清诱导的CTGF表达几乎被阻断。CDK大鼠血清处理后的YAP、pYAP和CTGF表达在加入SDX或VP后呈现一致的趋势。

由于CTGF不仅是YAP的靶效应分子，还是成纤维细胞标志蛋白，提示CKD诱导的YAP信号激活可能参与了内皮间质化进程。在内皮细胞中CTGF已经表达增强的情况下，本研究进一步检测了内皮细胞标志分子CD31表达情况。蛋白印迹结果显示，与正常大鼠血清处理组(Ctl组)相比，CKD大鼠血清处理(CKD serum组)细胞中，CD31水平降低(P <0.05,图5)。VP阻断YAP信号后CD31表达显著提升(P<0.05,图5A、E),舒洛地特处理后CD31表达水平与VP组一致(P <0.05,图5A、E)。结果表明，CKD大鼠血清诱导了内皮细胞表型转换，舒洛地特通过失活YAP抑制了内皮细胞间质化进程。

图5 舒洛地特阻止CKD大鼠血清诱导EAHy926细胞EndMT相关分子表达

3、讨论

3.1 内膜增生导致AVF功能障碍

具有功能且高流量的AVF是CKD患者必需的血透通路，而AVF失功会阻碍血液透析进程，严重影响患者的生命延续。过度的新生内膜增生是导致AVF功能障碍的重要原因之一。在我们以往研究中还发现在CKD患者及CKD小鼠AVF瘘口新生内膜增生会加重[12,13]。阻止新生内膜增生探讨改善AVF功能障碍的有效策略一直是重要的临床课题。本研究报道了舒洛地特可通过抑制CKD引起的YAP激活，阻止内皮间质化进程，从而减轻了AVF血管内膜增生。

3.2 舒洛地特对AVF的保护作用

舒洛地特是一种长效性、安全的内皮保护药物，具有抗凝血活性，能被血管内皮广泛吸收，其肠外和口服给药对血管疾病的作用已被充分证实，在许多国家已广泛使用[3]。此外，舒洛地特对其他疾病的作用也有不少报道。SHEN等[14]发现舒洛地特可减少心肌凋亡，保护心肌缺血/再灌注损伤。LIU等[15]发现舒洛地特可抑制糖尿病大鼠肾脏肾小管间质损伤，发挥抗衰老和抗氧化作用，防止糖尿病肾病的进展。SDX对AVF是否具有保护作用也引起了越来越多的关注。

最近的研究表明，舒洛地特在球囊损伤大鼠颈动脉模型中，减轻了新生内膜增生，舒洛地特通过重建糖萼维持内皮完整性，起到了保护内皮的作用[16]。因球囊对血管的损伤仅限于内皮层，另有学者利用大鼠股动脉与股静脉进行端侧缝合，建立大鼠AVF模型，在这种全横断面血管严重损伤情况下，舒洛地特也表现出阻止新生内膜增生的作用[17]。然而，研究中使用的AVF模型仅来自正常大鼠。为了更好地模拟CKD患者端端缝合的AVF,本研究对CKD大鼠右颈动脉和颈内静脉之间进行了AVF端端缝合，建立了CKD大鼠AVF模型，并利用SDX灌胃。结果证实，舒洛地特对CKD大鼠的新生内膜增生表现出有益的阻止作用(图2)。

3.3 舒洛地特通过失活YAP减轻新生内膜增生

新生内膜增生由血流动力学改变、内皮屏障损伤、尿毒症、缺氧、炎症等多种因素诱发，Hippo信号可作为血流动力学引起机械刺激的传感器。已有报道表明单向血流剪切力可抑制Hippo信号途径的转录共激活因子YAP,使其磷酸化，从而降低炎症因子表达，减轻动脉粥样硬化[18]。CKD大鼠AVF瘘口持续处于血流动力学改变及尿毒症的影响下，我们希望了解YAP在其中所起的作用。激活的YAP处于未磷酸化状态，可由胞质转位入核，与转录因子TEAD结合，启动CTGF 等靶基因表达。当Hippo通路激活时，通过上游激酶MST1/2磷酸化YAP,磷酸化的YAP在胞质中被降解，YAP信号被阻止[8]。因此，靶基因CTGF表达水平反映了YAP激活程度。本研究对CKD大鼠AVF检测结果表明，CKD大鼠动静脉瘘口处YAP和CTGF表达升高，磷酸化YAP处于低水平，表明CKD促进的新生内膜增生与YAP信号激活密切相关；舒洛地特的加入可阻止YAP的激活，减轻了CKD大鼠的新生内膜增生程度。

3.4 YAP激活促进内皮间质化

新生内膜增生显著特征为血管平滑肌细胞过度生长，内皮细胞间质化(endothelial-mesenchymal transition, EndMT)也是血管损伤后新生内膜增生过程中平滑肌细胞来源之一[19]。在EndMT的过程中，内皮细胞失去其特异性标志物，表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin)和I型胶原等间充质细胞标志物。既往也有研究报道TGF-β诱导的EndMT的过程中，需要YAP的激活[20]。REN等人还揭示了敲除血管内皮YAP基因可以抑制EndMT[21]。这些结果表明YAP可能是抑制EndMT的潜在靶点。CTGF不仅是Hippo信号转录因子YAP的下游靶效应分子，也是间质细胞标记物。在CKD大鼠AVF瘘口或CKD大鼠血清处理的内皮细胞中，YAP表达水平升高，CTGF表达上调(图4和5);本研究进一步检测了内皮细胞标志物CD31的表达，结果发现，伴随着YAP信号激活，CD31表达降低，而通过VP阻断YAP信号，可恢复CD31表达。舒洛地特具有与VP相似的作用，它可以通过促进YAP磷酸化使YAP失活，对EndMT进程起到抑制作用。

综上所述，本研究的数据表明，YAP激活是引起大鼠AVF失功的重要因素之一，CKD促进了EC中YAP去磷酸化和激活，引起内皮细胞间质化，加重新生内膜增生；舒洛地特可以通过阻止YAP激活，抑制CKD诱导的EndMT,从而减轻新生内膜增生，提升AVF的长期通畅率。

基金资助:陆军军医大学人才计划(2019); 重庆市科卫联合医学科研项目(2021MSXM256)~~;

文章来源:李雅馨,李冰玉,林鑫,等.舒洛地特失活YAP减轻大鼠动静脉瘘新生内膜增生[J].陆军军医大学学报,2024,46(12):1403-1409.