流行病学调查显示，全球约有14.3%的人群患慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD)[1],2022年亚洲成年CKD患者总数已高达4.343亿，我国CKD患者总数高达1.598亿，占全国人口的10.8%，其中晚期[依据估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,e GFR)<30 m L/（min·1.73 m2）标准]患者数量突破2 640万[2],2040年CKD或将成为前5位死亡原因之一[3]。CKD进展至终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）后依赖透析或肾移植维持生命，给患者家庭和社会带来沉重负担。根据中国CKD营养治疗临床实践指南（2021版），CKD 1～2期糖尿病肾病（diabetic kidney disease,DKD）患者避免高蛋白摄入[>1.3 g/（kg·d）]，建议蛋白质摄入量为0.8 g/（kg·d），建议CKD 3～5期非糖尿病患者低蛋白饮食[0.6 g/（kg·d）]或极低蛋白饮食[0.3 g/（kg·d）]，联合补充酮酸制剂[4]。我国广大居民习惯以大米为主食，稻米蛋白质含量约占糙米干质量的8%～10%，其中主要为可溶性谷蛋白（含量60%～75%），已超过KDOQI(Kidney Disease Outcome Quality Intiative）指南中关于肾脏疾病患者4%可溶性蛋白摄入量的要求[5]，因而长期食用正常谷蛋白大米会加重CKD患者的肾脏负担，更易发生ESRD。因此，本研究旨在研究低谷蛋白（low-glutelin,LG）大米延缓CKD小鼠肾功能恶化的作用，为CKD患者日常饮食和营养干预提供新的手段和理论依据。

1、材料和方法

1.1 材料

本研究大米选用LG大米（LG香粳，江苏农科院）和正常谷蛋白（normal-glutelin,NG）大米（南粳46，江苏农科院），采用全自动凯氏定氮仪（Kjeltec8400,FOSS公司，丹麦）测量米粉中的全氮含量，再乘以换算系数5.95计算总蛋白含量。取精米粉0.5 g，用提取液按顺序依次提取4种蛋白质，即清蛋白（10 mmol/L Tris-HCl,p H 7.5）、球蛋白（1 mol/L Na Cl,10 mmol/L Tris-HCl,p H 7.5）、醇溶蛋白（体积分数为55%的正丙醇，10 mmol/L Tris-HCl,p H7.5）和谷蛋白（质量分数为0.24%的Cu SO4·5H2O,1.68%的KOH,0.5%的酒石酸钾钠和体积分数为50%的异丙醇）。每次提取液用量为25 m L，室温下振荡2 h，其后于4 000 g离心10 min。清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的测定采用考马斯亮蓝法，谷蛋白的测定采用双缩脲法，分别计算4种蛋白的含量和所占比例，用凯氏定氮仪测定的总蛋白含量对各组分含量进行换算[6]。每个样品测定3次，取平均值。各组大米蛋白含量见表1。

表1 两组大米蛋白含量

1.2 方法

1.2.1 实验小鼠分组

6～8周龄无特定病原体（specific pathogen free,SPF）雄性BALB/c小鼠购自南京医科大学实验动物中心，体重23～25 g，共96只。采用随机数字法分为CKD、CKD-Control组，以及DKD、DKD-Control组，每组又分为LG大米喂养组（分别为LG-CKD、LG-CKD-Control和LG-DKD、LG-DKD-Control）和NG大米喂养组（NG-CKD、NG-CKD-Control和NG-DKD、NG-DKD-Control），每组12只。小鼠饲养于SPF屏障中，适应性饲养1周，保持恒温25℃，相对湿度70%的环境，12 h光/暗循环，自由摄入大米和水。本研究符合3R原则，已通过南京医科大学动物伦理委员会批准（IACUC-2311001）。

1.2.2 阿霉素诱导的CKD小鼠模型的构建

用随机数字法将SPF级BALB/c小鼠分为对照组（CKD-Control）和CKD组。CKD组小鼠尾静脉单次注射阿霉素（10 mg/kg),CKD-Control组小鼠尾静脉单次注射同体积生理盐水。造模8周检查24 h尿蛋白（24-hour urinary protein,24 h UPro）定量，CKD组与CKD-Control组有显著差异，且差异≥50 mg[7]确认为模型成功。

1.2.3 DKD小鼠模型的构建

通过高脂高糖饲料喂养小鼠4周，再连续5 d腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素建立小鼠DKD模型[8]；另取24只小鼠作为对照组（DKD-Control），以基础饲料喂养，同时腹腔注射相应剂量的柠檬酸钠缓冲液。注射结束1周后测量小鼠随机血糖和24 h UPro，以血糖≥16.7 mmol/L，且24 h UPro≥30 mg/d L为DKD小鼠模型建立成功的标准[9]。

1.2.4 血液学相关指标的检测

在造模成功后，分别喂养LG大米和NG大米，每周测量小鼠体重，第16周后眼眶取血，3 000 r/min、4℃离心10 min（离心半径10 cm），分离血清，于-18℃冰箱保存待测。血常规检测使用全自动血细胞分析仪。参照试剂盒说明书操作，检测血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN）、肌酐（serum creatinine,s Cr）、胱抑素（cystatin C,Cys C）、空腹血糖（fasting blood glucose,FBG）、总胆固醇（total cholesterol,TC）、甘油三酯（triglyceride,TG）、视黄醇结合蛋白（retinol binding protein,RBP）等指标。

1.2.5 尿微量白蛋白/尿肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio,m Alb/Cr）、24 h UPro定量检测

在造模成功后，分别喂养LG大米和NG大米，于第8周和16周分别收集小鼠尿液，将小鼠转移至代谢笼，禁食不禁水，收集24 h尿液后测定尿量，混匀后取1 m L,2 000 r/min、4℃离心（离心半径10 cm)10 min，去除沉渣后留取上清液于-20℃冰箱保存。参照试剂盒说明书操作流程，测定m Alb/Cr、24 h UPro等指标。

1.2.6 Masson染色

在造模成功后，分别喂养小鼠LG大米和NG大米16周，异氟烷吸入麻醉小鼠后颈椎脱位法处死。肾组织用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，4μm切片，Masson、HE染色后光镜下观察肾组织病理学变化[10]。肾间质纤维化评分依据Masson染色，按阳性区域面积评分：0分，无；1分，<25%;2分，≥25%～50%;3分，≥50%～75%;4分，≥75%。200倍光学显微镜下每张切片随机观察10个不重叠视野，取平均值作为肾小管损伤的指标。

1.2.7 转录组学分析

喂养16周处死小鼠后取出肾脏，将左肾立即浸入RNAlater溶液中，4℃过夜后转至-80℃保存。使用RNeasy Mini Kit提取总RNA。RNA完整性通过Agilent 2100生物分析仪评估，仅RIN值>8的样本用于后续实验。利用NEBNext UltraⅡDirectional RNA Library Prep Kit构建文库。在Illumina Nova Seq6000平台上进行150 bp双端测序，每个样本产生约40 million读段。原始数据经Fast QC质控和Trimmomatic过滤后，使用STAR将清洁读段比对到小鼠参考基因组（GRCm39）。采用Feature Count进行基因表达定量。差异表达分析使用DESeq2进行，设置标准为|log2Fold Change|≥1且调整后P值（FDR)<0.05。使用cluster Profiler进行KEGG富集分析。对差异表达基因进行GO富集分析，对其功能进行描述（结合GO注释结果）。根据GO分析的结果结合生物学意义挑选用于后续研究的基因。利用KEGG数据库对差异蛋白编码基因进行Pathway分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，符合正态分布的数据用均数±标准差表示，偏态分布数据则以中位数（四分位数）[M(P25,P75）]表示，两独立样本的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠摄食和体重变化

每日记录每只小鼠摄食量，汇总分析后可见同一时间点LG-CKD组和NG-CKD组、LG-DKD组和NG-DKD组小鼠的平均摄食量差异无统计学意义（图1），但DKD小鼠的摄食量明显高于CKD小鼠，表明LG大米或NG大米的口感、性状并未影响小鼠的正常进食。监测各组小鼠体重发现，随着喂养时间的延长，各组小鼠均能正常生长发育，干预8周后，NG-DKD小鼠的体重较LG-DKD小鼠下降，但差异无统计学意义，考虑与糖尿病进展相关；NG-DKD-Control组体重下降考虑与进食NG大米有关（图2）。

图1 各组小鼠摄食量变化趋势（n=12)

图2 各组小鼠饮食干预后体重的变化趋势（n=12)

2.2 LG干预对各组小鼠血清指标的影响

采用不同蛋白水平的大米喂养CKD和DKD小鼠16周，比较LG大米喂养组和NG大米喂养组，两组小鼠的红细胞（red blood cell,RBC）、白细胞（white blood cell,WBC）、血红蛋白（hemoglobin,Hb）、血小板（platelet,PLT）等血常规指标，差异无统计学意义（图3），血清总蛋白（total protein,TP）、白蛋白（albumin,ALB）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）、血钾（K+）、血钠（Na+）等指标差异也均无统计学意义（图4），表明LG大米喂养小鼠并未造成低蛋白血症等营养不良表现。

2.3 LG干预对CKD小鼠肾功能的影响

不同大米喂养16周，LG-CKD组较NG-CKD组小鼠的BUN、s Cr、Cys C水平降低，差异均有统计学意义（P值分别是0.004、0.030、0.010），尿酸（uric acid,UA）的差异没有统计学意义，表明喂养LG大米可延缓CKD小鼠肾功能恶化的进展（图5）。

2.4 LG干预对CKD小鼠尿液的影响

采用LG或NG大米喂养CKD及CKD-Conrtol小鼠，8周时LG-CKD与NG-CKD组尿量、m Alb/Cr、24 h UPro差异无统计学意义。第16周LG-CKD组m Alb/Cr和24 h UPro定量较8周时明显降低（P值分别0.040和0.001），尿量较8周时增加（P=0.043），而NG-CKD组尿量较LG-CKD组明显降低（P=0.002，图6），结果表明长期LG饮食干预可降低小鼠24 h UPro，对肾脏具有一定的保护作用。

2.5 LG干预对DKD小鼠血糖、血脂影响

不同大米喂养16周，LG-DKD组较NG-DKD组的FBG下降，差异有统计学意义（P=0.002),TC、TG、RBP水平组间差异无统计学意义，表明采用LG大米喂养可改善DKD小鼠的血糖变化（图7）。

2.6 LG对CKD和DKD小鼠肾脏病理的影响

喂养16周后，与LG-CKD-Control组比较，LG-CKD组肾小球间质未见系膜细胞增生，毛细血管袢无塌陷，肾小管基底膜增厚不明显，未见肾小管管型，未出现空泡样病变，管腔扩张，部分肾小球纤维化及间质纤维无增生，提示LG大米喂养延缓CKD小鼠的肾功能恶化。与LG-DKD-Control组比较，LG-DKD组小鼠未见明显肾小球萎缩、无基膜增厚，肾小球内无空泡形成，肾小囊未见变窄，肾小管水肿不明显（图8、9）。NG-CKD-Control与NG-DKD-Control组肾组织肾小球结构完整，清晰、肾小管上皮细胞排列规则，Masson染色未见间质纤维化。NG-CKD组HE染色可见肾小管出现不同程度的扩张与变形，Masson染色显示明显的纤维化增生。NG-DKD组HE染色可见肾组织肾小球体积增大且基底膜增厚，肾小管结构紊乱，且部分空泡变性，Masson染色显示肾小管间质轻度纤维化。NG-CKD与NG-DKD组的病理结果也提示造模成功（图10、11）。Masson评分显示，LG大米喂养的LG-CKD-Control组、LG-DKD-Control组、LG-CKD组、LG-DKD组分别是（5.5±0.5）、（5.3±0.5）、（5.2±0.4）、（7.2±0.4）分，差异有统计学意义（P<0.05);NG大米喂养的NG-CKD-Control组、NG-DKD-Control组、NG-CKD组、NG-DKD组分别是（5.4±0.5）、（5.6±0.8）、（14.2±0.7）、（11.8±0.6）分，差异有统计学意义（P<0.05）。

图3 不同饮食干预16周对各组小鼠血常规的影响

图4 不同饮食干预16周对血清营养学指标的影响

图5 不同饮食干预16周对CDK小鼠肾功能指标的影响

2.7 基于RNA-Seq的LG-CKD组和NG-CKD组小鼠肾脏转录组分析

LG或NG大米喂养16周后的LG-CKD组和NG-CKD组小鼠，差异表达基因4 026个，其中上调2 152个，下调1 874个，富集分析和热图分析发现JAK-STAT通路是延缓CKD小鼠肾纤维化进展的潜在机制（图12）。

图6 不同饮食干预8、16周对CKD组小鼠尿液的影响

图7 不同饮食干预16周对DKD小鼠血糖、血脂指标的影响

图8 LG大米喂养的CKD和DKD小鼠肾脏病理变化（HE染色）

3、讨论

我国是亚洲CKD发病率最高的国家[2]，营养治疗是CKD的主要干预措施之一，在延缓CKD进展及并发症防治中均发挥重要作用。鉴于我国居民饮食习惯以大米为主的特点，研发LG大米为CKD患者提供了切实可行的预防与治疗新途径，对改善CKD患者预后、提升其生活质量具有重要意义。

目前CKD患者的最主要病因是糖尿病，因此本研究选用了CKD模型以及DKD模型。本研究结果表明用LG大米喂养小鼠并未有低蛋白血症、贫血等营养不良表现。LG大米中谷蛋白水平明显低于NG大米，但是脂肪、碳水化合物等其他营养物质含量与NG大米基本一致，因此这两种模型都显示出良好的适应性，避免了单纯低蛋白饮食带来的体重减轻、贫血，也避免了人为剔除蛋白质，食物口感降低和蛋白摄入不足，出现营养不良等不良反应。

图9 LG大米喂养的CKD和DKD小鼠肾脏病理变化（Masson染色）

图1 0 NG大米喂养的CKD和DKD小鼠肾脏病理变化（HE染色）

图1 1 NG大米喂养的CKD和DKD小鼠肾脏病理变化（Masson染色）

本研究结果，CKD模型中LG-CKD组较NG-CKD组BUN、s Cr、Cys C皆明显下降，16周时LG-CKD组m Alb/Cr和24h Upro较8周时明显降低，表明LG大米可延缓肾功能恶化，LG-DKD组血糖指标改善。

LG大米在CKD和DKD患者中的治疗机制，初步分析如下：本研究中供试样品LG大米由具有低直链淀粉含量基因Wxmp和香味基因fgr的优良食味粳稻品种南粳46与含LG基因Lgc1的日本粳稻品种Lgc-1杂交、回交，是通过分子标记辅助选育的特殊营养功能大米，其不能被人体消化吸收的醇溶蛋白（4.47 g）比NG大米的醇溶蛋白（1.78 g）明显增加[6]，使蛋白吸收明显下降，减少氨基酸的摄入，减轻氮质血症和肾组织病理损伤，从而延缓ESRD的进展。研究表明，JAK-STAT通路激活可致足细胞特异性损伤，系膜扩张、肾小球基底膜增厚和小管间质纤维化[11],CD8+组织常驻记忆T细胞（tissueresident memory T cell,TRM）在CKD中的比例增加，促进足细胞损伤和肾小球硬化[12]。据报道，JAK/STAT通路抑制剂Tofacitinib可有效抑制MRL/lpr小鼠肾CD8+TRM细胞产生肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和颗粒酶B，从而抑制CD8+TRM细胞功能，改善肾功能[13]。本研究转录组学结果与其他研究一致，表明JAK-STAT通路是参与CKD的调控基因。CKD中JAK2、STAT1、STAT3和STAT5的高表达，而抑制JAK/STAT通路可以减少转化生长因子-β和纤维连接蛋白的合成，抑制STAT3可以减缓肾纤维化的进展，减少巨噬细胞和炎症细胞因子的产生[14]。Kitada等[15]研究表明，LG饮食通过限制氨基酸降低m TORC1活性来调节肾脏自噬，减轻肾小管间质损伤[16]，增加血液中的成纤维细胞生长因子-21的含量，降低血糖浓度，促进胰岛β细胞再生[17]。LG饮食既能控制DKD小鼠的血糖波动，又能延缓DKD肾功能受损的症状，因此，作为必不可少的主食，LG大米的应用就显得尤为重要。

图1 2 基于RNA-Seq的LG-CKD组和NG-CKD组的小鼠肾脏转录组分析

综上所述，基于CKD和DKD的严峻形势和居民自我健康管理意识的不断增强，饮食干预对慢性病的预防和治疗具有可观的研究价值。然而，本研究也存在一定缺陷，仅研究了LG大米在阿霉素诱导的CKD小鼠和高脂高糖饮食联合链脲佐菌素诱导的DKD模型小鼠中的作用，未进行其他CKD模型、糖尿病模型及大鼠模型的研究，未来将完善相关临床研究，进一步阐明食用LG大米改善CKD和DKD肾功能的机制。

参考文献:

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基金资助:上海市“科技创新行动计划”长三角科技创新共同体领域项目(21002411500);

文章来源:季明,乔汉连,马梦青,等.低谷蛋白大米延缓慢性肾脏病小鼠肾功能进展[J].南京医科大学学报(自然科学版),2024,44(11):1491-1498+1509.