伴随日新月异的工业发展，一些快速发展的弊端逐渐涌现出来，如加速工业化所带来化学用品的残留，生活用水污染及土壤重金属超标等一系列危害。大量重金属物质的残留无法在短时内得到妥善处理，使土壤中重金属超标，而土壤又是植物所必不可缺的生长资源[1]。目前，日益严峻的生长环境使得植物界正在面临着巨大的挑战[2]，土壤重金属污染对植物生长发育有着至关重要的影响，除了会使植物的正常生长发育受到影响，还会导致重金属逐渐累积在植物可食用部位，进而危害到人类的健康[3]。

根据全国土壤污染调查，导致重金属污染的是铜[4]。众所周知，铜是植物生长的必要矿质元素之一，少量的金属元素会促进植物的生长发育，一旦超过临界点便会对植物产生毒害作用[5-7]。在植物界当中，含铜量最高的亚细胞结构是植物体内的叶绿体，铜蛋白或铜离子是铜元素多数时的呈现形态，常游离在植物体内。由于铜元素是质体蓝素和叶绿素的重要结构组分，所以铜在光合电子传递链顺利进行过程和光合作用中起着至关重要的作用[8]。当植物体内铜元素含量不足时，植物的叶片表面开始出现黑绿现象直至凋零死亡。当植物长期处在铜离子摄入过量环境下，会导致出现离子毒害、氧化胁迫和渗透胁迫等现象，产生一系列毒害物质，如活性氧等，最终在植物体内出现的离子稳态平衡被打破，十分严重时会导致植物直接衰亡[9]。铜对生物体的毒效效应具体体现在细胞器的变化上，蛋白质分子的空间结构受到损害，细胞的生物膜系统被破坏及半自主性细胞器的破坏等。在小麦籽种萌动过程中，铜浓度过高可以抑制水解酶类的代谢活力，同样铜离子过量累积在浮游硅藻类体内会引起叶绿体荧光参数降低，产生光抑制，从而对光合作用产生影响。金属铜离子在植物体内过量累积导致类囊体结构受到损伤，光合作用受到严重抑制，致使光合产物形成减少。重金属胁迫可以增加细胞和细胞器中的抗氧机制，通常分为两方面：一方面是指细胞壁保卫作用与根系分泌物的排斥作用，另一方面主要包含抗氧化酶保卫作用、热休克蛋白保卫作用和细胞器纤维化及有机物质的解毒作用等[10-11]。

AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interacting Protein 1）属于拟南芥b ZIP家族中的一个转录因子，经科学家试验证明VIP1蛋白亚细胞定位在细胞核上。转录因子（transcription factors,TFs）能够以序列特异性方式结合DNA，并且调节转录的蛋白质。通过识别特定的DNA序列来控制染色质和转录，响应信号通路传导，形成指导基因组表达的复杂系统，在细胞器中发挥着不同的生物活性和作用。而信号通路调控基因表达是转录因子入核转运调控的主要途径。现阶段为止，有关转录因子VIP1的入核转运调控机制研究报道较多，且其大部分集中在核质穿梭机制及现象。目前国内外研究发现，转录因子VIP1在农杆菌转化过程中有着极其重要的地位，而且转录因子VIP1不仅可能涉及硫的利用、渗透胁迫信号传导，还与触导引起的根活动有关[12-13]。但是，目前关于AtVIP1在重金属胁迫中的探究还未明确，特别是在铜胁迫方面的研究还未见相关报道。因此，试验拟对过表达AtVIP1植株进行铜胁迫处理，通过分析其生长和生理生化指标，研究AtVIP1基因在植物抵抗铜胁迫方面的作用，为进一步解析植物响应重金属铜胁迫的机制提供理论依据，也为植物在耐非生物胁迫方面分子育种提供新的靶基因资源。

1、材料与方法

1.1 植物材料与处理

拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）野生型（WT）的生态型为Columbia-0,AtVIP1过表达株系（OE6和OE7）由本课题组通过遗传转化获得。1.5 mL离心管中放入约3 000粒拟南芥种子，然后加入1 mL 70%的乙醇（含0.05%吐温-20），用移液枪吹打使其充分混合，随后将混合均匀的拟南芥种子进行表面灭菌，条件为37℃、200 rpm，振荡10 min，弃乙醇；再加入95%的乙醇，以相同条件再灭菌1次；最后加入300～500μL无水乙醇，上下颠倒均匀，用移液枪吸出无水乙醇，静置待无水乙醇完全挥发，点种在无菌培养基上。不同拟南芥种子分别播种50粒在1/2 MS固体培养基（对照）和加入50μM CuSO4的1/2 MS固体培养基上（CuSO4处理），各做6组重复。避光4℃，放置2 d进行春化处理，在恒温恒湿实验培养箱中，25℃、16/8 h昼夜光照培养，计算萌发率和拍照观察拟南芥生长表型。为研究铜胁迫对野生型拟南芥AtVIP1过表达株系幼苗的影响，在无菌条件下将萌发后的幼苗移栽到培养基中，观察表型，测定幼苗生长指标和抗性生理指标。

1.2 试验方法

1.2.1 铜胁迫下不同株系拟南芥的萌发情况

为观察铜胁迫下野生型及过表达株系OE6、OE7拟南芥种子的萌发情况，种子在培养基中培养3 d后计算萌发率，10 d后拍照观察拟南芥萌发后生长情况。

1.2.2 铜胁迫下不同株系拟南芥幼苗的生长情况

为观察铜胁迫下野生型及过表达株系OE6、OE7拟南芥幼苗生长情况，在培养20 d和40 d时拍照观察表型；培养20 d后，测定各株系株高、根长、整株鲜重和干重、根部鲜重和干重，并计算整株和根部含水量。

1.2.3 铜胁迫下不同株系拟南芥丙二醛和电导率的测定

为分析铜胁迫对野生型及过表达株系OE6、OE7拟南芥的抗性生理指标的影响，培养40 d后取拟南芥幼苗叶片测定各指标，并拍照观察表型。电导率测定的具体过程：选取不同处理下拟南芥不同株系相同叶位的叶片，小心取下叶子，在装有蒸馏水的小烧杯中小心清洗数次，捞出放置在滤纸上，期间重复翻面，将叶片表面多余水分吸干；把叶片剪成小块放入100 m L烧杯，加入20 mL蒸馏水，使叶片全部浸泡在蒸馏水中，把烧杯放入真空干燥器中抽滤成真空状态，使叶片细胞间隙中的空气被抽出，抽滤结束后将其放置在室温条件下20 min，使用电导率测定仪测定溶液电导率；测定结束后将其放置在沸水中加热10～20 min，使植物叶片死亡，加热结束后待其降至室温，再次测定煮沸植物组织溶液的电导率。丙二醛（MDA）含量测定利用格锐思生物科技有限公司生产的试剂盒，具体过程参照说明书进行。

1.2.4 铜胁迫下不同株系拟南芥的抗性酶活性的测定

为探究铜胁迫下野生型及过表达株系OE6、OE7拟南芥幼苗中抗氧化酶POD、CAT和SOD等酶的活性，培养40 d后取拟南芥幼苗叶片，利用格锐思生物科技有限公司生产的生化试剂盒测定酶的活性，具体过程参照各种酶试剂盒的说明书进行。

1.3 数据统计分析

利用Excel 2019软件进行数据统计及作图。采用独立样本t检验，利用SPSS 25软件进行数据统计分析，P<0.05表示数据具有统计学意义。

2、结果与分析

2.1 铜胁迫对不同株系拟南芥种子萌发的影响

不同株系拟南芥的萌发情况如图1A所示，发芽率如图1B所示。在正常条件下培养（对照），AtVIP1过表达植株（OE6、OE7）与野生型（WT）的萌发表型和发芽率没有显著差异。但在铜胁迫下，与对照相比，WT、OE6和OE7的生长都受到抑制；但OE6和OE7表现出更好的生长状态，且种子发芽率显著高于WT(P<0.05），其中AtVIP1过表达植株OE6和OE7的发芽率分别为92%和96%，而野生型WT的发芽率只有71%。

图1 铜胁迫对不同株系拟南芥种子萌发的影响

2.2 铜胁迫对不同株系拟南芥幼苗的影响

2.2.1 铜胁迫20 d对不同株系拟南芥幼苗地上部生长的影响

铜胁迫20 d对不同株系拟南芥幼苗地上部生长的影响如图2所示。正常生长条件下，拟南芥各株系幼苗的生长未见明显差异；经铜胁迫处理后，AtVIP1过表达植株OE6和OE7的生长情况明显好于WT植株（图2A);WT植株的叶片面积小，部分叶片发生卷曲，同时发生失绿现象；而在铜胁迫后，OE6和OE7叶片形态与正常条件下的差异不明显（图2B）。铜胁迫处理后，WT、OE6和OE7等不同株系拟南芥地上部的株高和整株干重均显著下降（P<0.05）；但相较于WT,AtVIP1过表达植株OE6和OE7受的损伤较轻（图2C）。含水量是反映植物水分状态的重要指标，铜胁迫处理后，与对照组相比，OE6和OE7幼苗的含水量无显著变化，但WT的含水量则显著下降（P<0.05）。可见，在铜胁迫下，OE6和OE7拟南芥植株更好地保持住地上部水分来维持植物生长发育。

2.2.2 铜胁迫20 d对不同株系拟南芥幼苗根系生长的影响

不同株系拟南芥幼苗根系在铜胁迫下的生长如图3所示。在正常生长条件下，AtVIP1过表达植株OE6、OE7与WT各个株系根长之间没有明显差异；在铜胁迫处理下，植株根部的伸长生长均受到显著抑制（P<0.05），但WT被影响较大，根长仅为5.9 cm，而AtVIP1过表达植株的根长受到影响较小，为8.7 cm左右（图3A,3B）。经铜胁迫处理后，不同拟南芥株系根部的干重和含水量均显著下降（P<0.05），但OE6和OE7根干重显著高于WT（图3B）；拟南芥根在正常生长条件下含水量均达到95%左右，经铜胁迫处理后，WT、OE6和OE7根部的含水量下降了10%左右，但AtVIP1过表达植株根含水量仍显著高于WT(P<0.05）。可见，在铜胁迫下，AtVIP1过表达植株具有较强抵抗胁迫的能力，使植物在胁迫下的生长发育受到伤害程度减小。

图2 铜胁迫20 d对不同株系拟南芥幼苗生长的影响

2.2.3 铜胁迫40 d对不同株系拟南芥幼苗生长的影响

铜胁迫40 d对不同株系拟南芥幼苗生长的影响如图4所示。随着铜胁迫过程的持续，野生型和AtVIP1过表达株系拟南芥的生长差异更加明显。野生型幼苗矮小，叶片小而黄白，根分支少且短；而2个AtVIP1过表达株系OE6和OE7幼苗较大，叶片略有黄白，但只发生在老叶上，根分支较多且长。与野生型相比，AtVIP1过表达株系对铜胁迫的耐受性更好。

图3 铜胁迫20 d对不同株系拟南芥根部生长的影响

图4 铜胁迫40 d对不同株系拟南芥幼苗生长的影响

2.3 铜胁迫对不同株系拟南芥抗性生理指标的影响

2.3.1 铜胁迫对不同株系拟南芥MDA和电导率的影响

一些研究表明，过量铜会导致生物体内形成大量的活性氧（ROS），增加机体自身清理ROS的负担，可导致体内抗氧化压力增大，使机体内氧化系统失去平衡，产生应激反应，造成DNA损伤和膜脂过氧化，使有毒物质在细胞内积累，最终引起机体细胞死亡。铜胁迫对不同株系拟南芥MDA和电导率的影响如图5所示，在正常生长条件下，与WT相比，AtVIP1过表达植株OE6、OE7中MDA含量和电导率均无显著差异；但经铜胁迫处理后，拟南芥所有株系的MDA含量和电导率均显著增加，WT增加幅度更大，且显著高于OE6和OE7(P<0.05）。可见，在铜胁迫下，WT植株所受的伤害更大。

2.3.2 铜胁迫对不同株系拟南芥抗氧化酶系统的影响

铜胁迫对不同株系拟南芥抗氧化酶的影响如图6所示。在铜胁迫下，拟南芥所有株系植株体内SOD、POD和CAT酶活性显著升高，而AtVIP1过表达植株OE6和OE7的3种酶活性均显著高于WT(P<0.05）。与对照相比，OE6和OE7植株体内SOD的活性提高了80%左右，野生型也提高了11%左右；OE6和OE7的POD的活性增加了约26%,WT增加了12%；而CAT活性在OE6和OE7体内上升了3.8倍左右，野生型则上升了2.6倍左右。由此可见，经铜胁迫处理后所有抗氧化酶活性都增加，而AtVIP1基因过表达可正调控SOD、POD和CAT等酶的活性，从而提高铜胁迫下过表达拟南芥植株对铜胁迫的耐受性。

图5 铜胁迫对不同株系拟南芥MDA和电导率的影响

图6 铜胁迫对不同株系拟南芥抗氧化酶的影响

3、讨论

铜是植物生长必不可缺的微量元素之一，但是过量的铜会严重危害植物生长发育[15]，最终导致生物量的累积大幅降低。为适应复杂多变的生态环境，植物常常通过改变本身的生理形态和代谢来达到生存的目的。根是最先接触土壤的器官，在整个铜胁迫感应过程中起重要作用[16]。在遭受到铜胁迫后，植物的吸水能力大大减弱，再叠加水分的丢失，会破坏植物渗透调节环境的稳态，从而使生物量降低[17]。研究中，在铜胁迫下，AtVIP1基因过表达植株仍可以使细胞维持较高的含水量，从而降低渗透势，使细胞的保水能力增强，进一步减轻铜胁迫所带来的危害，这与李亚茹等[18]的研究结果一致。VIP1是转录因子，是MPK3的靶标，被认为与植物防御反应有关[12-13]。Kim B M等[19]发现，过量的铜导致植物生长迟缓，但是也有些植物受到较小的影响，说明在铜胁迫下植物体内有一定的自身调节作用。研究中，相比于拟南芥野生植株，过表达AtVIP1基因的植株无论是地上部还是地下部均对CuSO4胁迫具有显著的耐受性，主要反映在根部的伸长，未受到显著影响，含水量降低幅度较小等，使植物生长受到抑制程度降低。

许多研究发现，细胞膜的通透性会在胁迫条件下发生改变，生物膜受损伤程度常用细胞MDA含量来作为判断标准，生物膜是由膜脂构成，MDA是其过氧化的终产物，MDA的含量过高会严重破坏膜结构[20]。研究中，伴随铜胁迫发生的进程，MDA大量累积，不同株系的拟南芥MDA含量均比对照组显著升高，而AtVIP1基因过表达植株的MDA含量显著低于WT，刘泽静等[21]的研究结果也得出类似结论。电导率可衡量植物遭到迫害后生物膜的损伤情况，组织间相对电导率越大，细胞膜受害程度越重，膜通透性越强[22]。在铜胁迫下，AtVIP1基因过表达植株的电导率显著小于WT。以上结果表明，过表达AtVIP1基因在一定程度上可缓解膜脂过度氧化和维持细胞膜结构。

当植物受到胁迫时，植物体内会有大量活性氧累积和过氧化物生成，可导致植物体内代谢紊乱，从而抑制植物正常生长发育[23]，保护酶系统在逆境条件下被活化，启动抗氧化系统在植物体内形成一种保护机制。抗氧化酶系统包括SOD、POD和CAT等，所以可通过测定抗氧化酶的活性来衡量植物对胁迫的耐受程度[24]。研究中，在铜胁迫下AtVIP1基因过表达植株的抗氧化酶活性均显著高于WT，这说明在铜胁迫下过表达AtVIP1基因可能会提高抗氧化酶的活性，从而通过增强清除ROS的能力来减轻有害物质对植物的伤害，从而提高拟南芥对铜胁迫的耐受性。杨云生等[25]的研究结果也表明，过表达AtJ8基因可通过提高拟南芥在铜胁迫下SOD、POD和CAT酶活性来清除体内过量的ROS，使ROS在植株体内处于稳态。

4、结论

AtVIP1基因过表达能够提高铜胁迫下拟南芥种子的发芽率，降低铜胁迫对幼苗生长的抑制，可提高SOD、POD和CAT酶活性，减少MDA有毒物质的产生，降低细胞膜的通透性，能提高拟南芥对铜胁迫的抗性，但其具体机制还有待进一步研究。

参考文献:

[13]赵佩,腾丽杰,王轲,等.小麦TaVIP1家族基因克隆､分子特性及功能分析[J].作物学报,2017,43(2):201-209.

[15]尚誉,桑楠.煤矸石堆积区周边土壤重金属污染特征与植物毒性[J].环境科学,2022,43(7):3773-3780.

[18]李亚茹,孙浩月,张琦,等.有机硒对绿豆萌发及叶部生理指标的影响[J].黑龙江八一农垦大学学报,2021,33(5):7-14.

[20]范俊臣,张之为.超表达StRab5b基因对马铃薯耐盐生理特性的影响[J].山东农业科学,2022,54(9):49-54.

[21]刘泽静,张玲.盐胁迫对非洲凤仙花实生苗细胞膜透性和丙二醛含量的影响[J].现代农业科技,2012(21):186-192.

[22]关利平,张伟,王紫寒,等.铜胁迫对葡萄根系活性氧和抗氧化酶活性的影响[J].中外葡萄与葡萄酒,2019(3):33-36.

[25]杨云生,商鑫涛,陈晨,等.过表达AtJ8基因增强转基因拟南芥对铜胁迫的抗性[J].植物生理学报,2019,55(6):847-857.

基金资助:黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2022C062);黑龙江省省属科研院所科研业务费项目(CZKYF2022-1-B025);

文章来源:李学影,李征杭,赵阳,等.过表达AtVIP1基因增强转基因拟南芥对铜胁迫的抗性[J].黑龙江八一农垦大学学报,2024,36(06):79-85+92.