内皮细胞作为循环系统与外周组织之间的屏障，发挥众多生理作用[1]。内皮细胞功能发生障碍导致血管炎症、动脉粥样硬化、高血压病、心肌病、视网膜病、神经病变和癌症等病理状况[2]。原代人脐静脉内皮细胞（primary human umbilical vein endothelial cells,p HUVECs）取材方便[3]，最初的传代几乎保持了天然血管内皮细胞的所有特征，是创建动脉粥样硬化、血栓形成、心肌梗死和肿瘤血管生成等疾病模型的重要材料[4]。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA）已被证明在内皮细胞功能中发挥重要调控作用[5-7]。使用RNA干扰技术（RNA interference,RNAi）沉默lnc RNA的表达已成为基础医学研究中常用的方法[8-9]，而基因沉默效率的高低成为基础研究中重要的指标。

鉴于人脐带取材方便，p HUVECs是研究众多心血管疾病理想的体外细胞模型的材料。而lnc RNA在内皮细胞中研究相对较少，且p HUVECs基因沉默效率较低。因此，通过成功分离高纯度的p HUVECs培养并建立经济且高效的沉默lnc RNA的方法，将方便众多科研学者更高效建立研究lnc RNA调控内皮功能的疾病模型。本研究使用健康剖宫产产妇脐带提取p HUVECs，培养2～5代用于脂质体转染si RNA沉默小核仁RNA宿主基因8(lnc RNA small nucleolus RNA host gene 8,lnc RNA SNHG8）来验证在p HUVECs中沉默lnc RNA的效率。

1、材料与方法

1.1标本来源

实验所用脐带来自福建医科大学附属第一医院健康产妇剖宫产的新生儿脐带，在无菌条件下获取脐带（长度约20 cm）后放入含M199培养基的无菌容器中，置冰盒内转移至超净台，2 h内分离p HUVECs。本研究经福建医科大学附属第一医院医学伦理委员会批准（研究许可证号：2020-0117），所有产妇均知情同意。

1.2主要试剂和仪器

内皮细胞培养基（endothelial cell medium,ECM)(001）购自美国Scien Cell公司；M199(01-080-1ACS）购自以色列Biological Industries公司；Ⅰ型胶原酶（C0130）购自美国Sigma公司；兔抗人CD31单克隆抗体（A4900）、FITC Goat Anti-Rabbit二抗（AS011）均购自武汉Abclonal公司；兔抗人FactorⅧ单克隆抗体（ZM-0022）购自北京中杉金桥公司；si-SNHG8及RNAFIT购自上海汉恒生物公司；Hieff q PCR SYBR Green Master Mix(11202ES03）购自上海祤圣公司；q PCR仪（Quant Studio5）购自美国Thermo Fisher Scienntific公司。

1.3 p HUVECs的分离

原代人脐静脉内皮细胞的分离方法参考以往的报道[10-11]，简述步骤如下：留取脐带长度约20 cm，使用预热的PBS，冲洗脐带，脐静脉内注入37℃预热的0.1%Ⅰ型胶原酶10 m L D-hank's配制液消化15 min，收集脐静脉中液体并加入等体积含5%胎牛血清培养液终止消化，分装后800×g离心5 min，加入ECM培养液重悬后移至37℃、5%CO2培养箱。

1.4 p HUVECs的培养

分离的p HUVECs静置培养24 h后换液并PBS洗2～3次，以除去未贴壁的内皮细胞和红细胞，并给予含5%胎牛血清配制的培养基（ECM∶M199=4∶1）持续培养。使用倒置相差显微镜每天观察原代内皮细胞生长状态并拍片。约48 h后细胞融合度达80%～90%左右，可进行传代。以后每隔2 d换液1次，取2～5代用于下一步实验。

1.5 p HUVECs的免疫荧光鉴定

将细胞爬片放入24孔板中，每孔加入p HUVECs悬液100μL及完全培养液400μL，置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。待细胞生长至90%时，每孔放入4%多聚甲醛固定30 min。固定结束，每孔加入0.1%Triton X-100通透20 min。通透后，每孔加入5%BSA封闭30 min。封闭结束，各样品分别滴加兔抗人FactorⅧ单抗（1∶100）和兔抗人CD31单抗（1∶100），空白对照一抗用PBS代替，放入湿盒内4℃摇床孵育过夜。次日用PBS冲洗后加入FITC标记的二抗（1∶100）避光孵育1 h。避光环境下，各样品加入DAPI，室温静置5 min。PBS清洗后，小心取出细胞爬片，滴加抗荧光淬灭剂、封固。在保持位置、大小、亮度、对比度、饱和度、伽马值等参数不变的条件下使用荧光显微镜观察并拍照，每个样品至少随机选择5个视野拍照。1.6免疫荧光筛选si RNA转染最佳浓度把制备好的浓度为3×105/m L的p HUVECs悬液1 m L/孔加入6孔板中，添加培养基至2 m L/孔，吹打混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。待细胞生长至80%，使用脂质体将不同浓度si RNA-Fam转染p HUVECs，并设置CTL组、1 nmol/L si RNA-Fam组、10 nmol/L si RNA-Fam组、20 nmol/L si RNA-Fam组、50 nmol/L si RNA-Fam组、100 nmol/L si RNA-Fam组。6 h后弃去转染液，PBS清洗，使用倒置荧光显微镜观察不同浓度组荧光强度来反映各组si RNA转染效率，并使用Image J软件分析各组中平均荧光强度。随后为了筛选最佳转染脂质体用量，用不同浓度脂质体转染si RNA-SNHG8，设置CTL组、1μL RNAFIT组、3μL RNAFIT组、5μL RNAFIT组、10μL RNAFIT组，转染si RNA-SNHG8后，实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR）检测SNHG8表达。

1.7 p HUVECs的转染

细胞培养在6孔板内，待细胞融合度达60%～70%时将si RNA-SNHG8的3条序列（由上海汉恒公司设计合成）转染，RNA序列见表1，并设置空白组、阴性对照组、si-SNHG8 1#组、siSNHG8 2#组、si-SNHG8 3#组、si-SNHG8 1+2+3#组。取50 nmol/L si RNA和5μL RNAFIT(RNA专用脂质体转染试剂）分别稀释到100μL 1%胎牛血清培养基中，混匀后静置5 min。将si RNA稀释液与RNAFIT稀释液混合孵育10 min形成转染复合物。将孵育好的转染复合物分别加入对应的孔内，置37℃细胞培养箱培养。转染6 h更换新鲜完全培养液继续培养。

表1 RNA序列

1.8 RT-q PCR反应

按照Transzol up plus RNA Kit厂家说明书（ER501-01，购自北京全式金公司）提取各组细胞RNA，使用紫外分光光度法测RNA样本的浓度和纯度（260/280 nm OD值为2.0），取1μg样本加入RT-q PCR。将Hieff Strand c DNA Synthesis Super MIx按照厂家说明书（11141ES60，购自上海祤圣公司）配制逆转录反应体系，置于PCR仪，设置反应参数37℃×15 min,85℃5 s,4℃结束。将得到的反转录溶液稀释后按照Hieff q PCR SYBR Green Master Mix厂家说明书（11202ES03，购自上海祤圣公司）配制PCR反应体系，置于q PCR仪中，设置q PCR反应程序：预变性95℃5 min、变性95℃10 s、退火60℃34 s，循环数40。q PCR反应结束后确认扩增曲线和融解曲线，使用2-△△CT法计算内参及目的基因的相对表达量。引物序列见表2。

1.9统计学分析

表2 引物信息

每次实验均设置3复孔，实验数据采用Graph Pad Prism 8统计分析及制图。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（Oneway ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 p HUVECs的形态学及免疫荧光鉴定

分离的p HUVECs在培养24 h后多成团聚集，少数细胞分散分布。约48 h后可达到80%～90%融合状态，此时细胞形态均一，呈典型的鹅卵石样排列，细胞核清晰，见图1A（封二）。免疫荧光法检测p HUVECs特异性Ⅷ因子和CD31的表达，可见p HUVECs呈荧光阳性。DAPI染色后细胞核呈蓝色，Ⅷ因子抗体FITC染色后在细胞胞浆中可见均匀地分布着绿色荧光颗粒，而CD31抗体FITC染色后的荧光主要集中在细胞膜及胞间连接上，符合内皮细胞特征，而未加一抗的空白对照细胞中，几乎未见荧光，见图1B（封二）。上述结果表明成功提取到高纯度的p HUVECs。

2.2 p HUVECs的si RNA转染最佳浓度

与CTL组比较，50 nmol/L si RNA-Fam组荧光强度较高[（10.55±0.15) vs.(50.72±1.25）]，差异有统计学意义（t=32.020,P<0.000 1），即转染效率最高；而50 nmol/L si RNA-Fam组与100 nmol/L si RNA-Fam组比较[（50.72±1.25) vs.(53.25±1.06）]，差异无统计学意义（t=1.544,P=0.197 5），见图2A、B（封二）。随后用RT-q PCR检测SNHG8表达。结果显示，与CTL组比较，5μL和10μL RNAFIT组SNHG8表达均较低[（1.00±0.00) vs.(0.65±0.01),(1.00±0.00) vs.(0.62±0.02）]，差异均有统计学意义（t=36.030、19.890,P均<0.001),5μL与10μL RNAFIT组比较，差异无统计学意义（t=1.392,P=0.236 4），见图2C（封二）。10μL RNAFIT组细胞死亡较5μL RNAFIT组多，故选用50 nmol/L si RNA-Fam和5μL RNAFIT用于下一步转染实验。

2.3 p HUVECs的SNHG8沉默效率验证

转染24 h后，与CTL组比较，si-SNHG8 3#组及si-SNHG8 1+2+3#组沉默SNHG8的效率最高[（100.00±0.00)%vs.(62.35±2.70)%,(100.00±0.00)%vs.(57.16±9.30）%]，差异均有统计学意义（t=13.950、4.606,P均<0.05);CTL组与si-NC组、si-SNHG8 1+2+3#组与si-SNHG83#组之间[（100.00±0.00)%vs.(103.50±17.29)%,(57.16±9.30)%vs.(62.35±2.70）%]，差异均无统计学意义（t=0.201、0.535,P=0.850 3、0.620 8），见图3A。转染48及72 h后，与CTL组比较，si-SNHG8 1+2+3#组沉默SNHG8的效率均较高[（100.00±0.00)%vs.(47.27±1.09)%,(100.00±0.00)%vs.(36.35±2.63）%]，差异均有统计学意义（t=48.620、24.160,P均<0.000 1），与si-SNHG8 3#组比较，si-SNHG8 1+2+3#组沉默SNHG8的效率更高[（61.80±1.12)%vs.(47.27±1.09)%,(49.95±2.07)%vs.(36.35±2.63）%]，差异均有统计学意义（t=9.316、4.055,P均<0.05），见图3B、C。随后设立si-SNHG8 1+2+3#转染组的时间梯度检测SNHG8的表达，结果发现，与CTL组比较，siSNHG8 1+2+3#转染后呈时间依赖性抑制SNHG8表达，72 h组沉默效率最高[（100.00±0.00)%vs.(36.35±2.63）%]，差异有统计学意义（t=24.160,P<0.000 1），见图3D。

3、讨论

内皮功能障碍是心血管疾病、代谢疾病和新发传染病的标志。非编码RNA对内皮功能障碍的调节为针对内皮功能障碍的药物研发提供了新的思路[12-13]。既往研究发现，HUVECs转染效率较低主要与磷脂双分子层的电荷屏障及内皮细胞保护的生物屏障机制相关[14]。本研究使用新生儿脐带成功分离高纯度高活力p HUVECs，成功探索将3条si RNA-SNHG8共同转染p HUVECs相比单条si RNA转染获得的沉默效率更高。该方法具有取材方便、成本低廉、技术简单、沉默效率高的特点，有利于研究人员快速建立高效的沉默lnc RNA的内皮细胞模型。

图3 p HUVECs的SNHG8沉默效率验证

1973年JAFFE等[15]成功从脐静脉分离出内皮细胞，其取材容易、操作简便，且与细胞系和实验动物比较，p HUVECs实验更符合人体，更具有病理生理意义。因此，目前p HUVECs常作为动脉粥样硬化等血管疾病研究的细胞模型[16-17]。分离p HUVECs的方法有机械刮取、组织块移植和酶消化法3种[18]，近年来主要采用胶原酶灌注消化法[4,19]。Ⅷ因子和CD31常用于内皮细胞鉴定[20]。本研究分离的p HUVECs纯度及活力均较高，总结p HUVECs分离和培养过程中的技术细节如下：(1)严格的无菌操作，包括所需器械均需严格高压蒸汽灭菌，使用新开封的无菌试剂和耗材等；(2)留取脐带长度以20 cm为佳，剪取脐带后要及时挤净脐带血，避免发生凝血，2 h内完成从脐带中分离内皮细胞；(3)使用D-Hank's培养基（红色）配制浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶溶液相较于使用PBS（无色）配制胶原酶，在注入脐静脉后更容易观察胶原酶溶液充盈及有无漏液等情况；(4)胶原酶溶液及冲洗脐带的PBS需提前置于37℃预热；(5)灌胃针注入胶原酶溶液后，立即使用血管钳夹闭脐带上端以防消化液逆流出灌胃针；(6)消化后溶液和PBS冲洗液分装于多根15 m L离心管中，离心后加入完全培养液重悬，再次离心；(7)完全培养液采用ECM∶M199=1∶4比例混合，再加入胎牛血清配制成5%胎牛血清内皮细胞培养液，相较ECM原液价格更经济；(8)p HUVECs一般2～4代生长速度最快，5代后生长相对速度下降，而10代后生长速度显著缓慢且形态变化，故应取5代内细胞用于实验为佳。

近年来基因敲除技术和RNAi技术已成为基础研究和开发新型药物的新思路[21-23]。RNAi技术是一种由小RNA介导的转录后基因沉默机制[24]。与敲除基因技术比较，si RNA技术提供了一种更便宜、更有效的方法来创建敲除基因样本[25-26]。si RNA技术中常用的生物方法有病毒感染，物理方法有电穿孔和显微注射，化学方法有磷酸钙法、脂质体和纳米颗粒载体[27-29]。其中显病毒和纳米颗粒载体转染效率较高，有研究表明，通过构建动物EFNA2基因短发卡RNA(short hairpin RNA,sh RNA）慢病毒载体，将其感染原代听神经细胞，RT-PCR检测EFNA2基因的m RNA表达水平最高下降达76.11%[30]。使用GalPEG-PEI纳米基因载体介导的psi RNA对Hep G2细胞HLA-E干扰效率达55%(m RNA水平）和62%（蛋白水平）[31]。但使用病毒和纳米颗粒载体转染成本昂贵，不适合原代细胞的瞬时转染。本研究发现使用脂质体载体转染技术将3条si RNA共同转染的沉默效率能接近前两者的水平，同时操作方法简便，技术成熟，准备周期短，也更经济。总结p HUVECs中沉默lnc RNA的技术细节如下：(1)转染前筛选si RNA和脂质体最佳浓度；(2)转染前细胞密度建议60%～70%左右，过低和过高的细胞密度可能导致脱靶效应和死亡增加；(3)使用1%血清培养液配制转染试剂和si RNA，而不是使用无血清培养基，可显著减少细胞死亡发生，同时也不明显影响转染效率；(4)转染后6 h内换液，过长时间换液将导致细胞死亡显著增加。

本研究也存在一些不足之处，如未做不同脂质体之间转染效率的比较；仅通过显微镜观察细胞状态，而未做细胞活力曲线实验；同时该研究仅代表原代内皮细胞的沉默lnc RNA效率验证，而在其他细胞或沉默其他类型RNA方面有待进一步验证。今后应进一步完善相关实验。综上所述，本研究建立了一个在p HUVECs中高效、简便、经济的沉默lnc RNA的方法，为lnc RNA参与内皮功能研究和筛选关键分子靶标提供了重要的途径。

下图1～2：樊宗成，马康源，程小兵，等.原代人脐静脉内皮细胞的分离及沉默长链非编码RNA效率验证

图1 p HUVECs的鉴定（细胞免疫荧光，×400)

图2 p HUVECs的si RNA转染最佳浓度（细胞免疫荧光，×100)

参考文献:

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基金资助:国家自然科学基金(81970370); 福建省科技创新联合基金(2021Y9121); 福建省卫生科技项目(2020QNA056); 福建省卫生健康科研人才培养项目(2019-1-40); 合肥市第三人民医院科研项目(SYKZ202201);

文章来源:樊宗成,马康源,程小兵,等.原代人脐静脉内皮细胞的分离及沉默长链非编码RNA效率验证[J].热带医学杂志,2024,24(08):1067-1072+1083+1062.