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试析如何完善微生物培养基设计

2020-06-02 511 上传者：管理员

摘要：通过对微生物培养基成分的组成、培养基的设计、培养基的优化方法三个方面进行研究，得出培养基成分的组成是关键，只有确定成分，才能设计培养基的条件，从而进一步优化培养基。研究结果表明，优化的最佳方法是响应面优化设计法，其次是正交实验设计法，最后才是单因素试验法。

关键词：
优化方法
发酵
培养基成分
微生物学
设计
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微生物生长需要营养成分，为适应微生物生长，需要设计不同的培养基以满足微生物生长的需要，不同培养基其成分是不同的，其中任何一个成分的改变都会影响到微生物的生长繁殖。各营养物质之间的比例、搭配对微生物生长都会有影响。微生物在发酵工业中应用广泛，酒、醋、酱油、酸奶、面包等生产中都会用到微生物。培养基是微生物工业化生产的关键之一，只有设计优化好培养基，才能最大程度地满足微生物生长的最佳条件，提高微生物的产量。由此可见微生物培养基的设计优化在微生物工业化生产中的重要作用。本文就微生物培养基的设计优化进行一些探讨。

1、确定培养基的成分

微生物培养基是由人工配制供微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。根据微生物对营养物质的要求来配制，培养基一般有水分、碳源、氮源、无机盐、生长素等物质。绝大多数的微生物都能够在人工配制的培养基上生长。碳源氮源是微生物生长最基本的原料。确定培养基成分的基本原则：要明确配制的目的；培养哪种微生物；是获得菌体还是代谢产物；是一般的研究还是遗传学研究；是生理生化鉴定还是其它等等，根据目的不同选择相应的培养基和培养基的成分。有时还要考虑筛选菌种来源的地点、环境等因素。

在确定培养基成分时，要按照微生物营养特点来配制，一般来讲要含有微生物最适应生长需要的一切营养物质。不同营养类型的微生物对营养物质的要求是不同的，培养自养型微生物，培养基成分应全部是简单的无机物，不能有有机物；培养异养型微生物，培养基中则至少有一种有机碳源和能源。如在培养化能自养型微生物氧化硫杆菌时，培养基中并未专门加入其它碳源物质，而是依靠空气和溶于水中的二氧化碳为其提供碳源。每种类型的微生物都能在同一种带有共性的培养基上生长。如化能异养的细菌是肉汤培养基；酵母菌是麦芽汁培养基；霉菌是查氏培养基；放线菌是高氏1号培养基，它们分别在各自的培养基上都能生长。

在配制培养基的过程中，为了获得菌体或种子，可以使培养基的成分丰富一些，那么氮源的含量要高些；如果为了获得代谢产物或发酵培养基，含氮量一定要低一些，以免微生物生长过旺影响代谢产物的积累。有些代谢产物的积累还需要额外加入一些作为它们组成部分的元素或前体物质。如金霉素生产中要加入氯化物，青霉素生产中要加入前体物质笨乙酸。因此培养基中到底需要哪些成分，是培养基优化的前提条件。

2、养基的设计

2.1培养基营养物质浓度的组成和比列

培养基的成分确定后，每种营养物质的浓度和比列要合适，要达到微生物生长的最适条件下微生物才能迅速生长。营养物质的浓度太低不能满足微生物的生长需要，太高又会抑制微生物的生长。比如金属离子是微生物生长不可缺少的矿物质养分，但如果矿物质的浓度过大就会抑制菌体的生长，甚至杀死菌体。碳氮比（C/N）是影响微生物生长繁殖和代谢积累的重要因素，常作为一个指标来衡量之间的搭配，如在谷氨酸发酵中，当培养基（C/N）比为4∶1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累减少；当培养基（C/N）比为3∶1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸大量增加。一般培养基碳氮比（C/N）为100∶（0.5-2）。

2.2调节培养基的pH值

在设计培养基时，除微生物营养物质之间的比列外，pH值也是微生物生长繁殖和代谢积累很重要的一个环境指标。一般来说，细菌适合pH值7.0-7.5，酵母菌为3.8-6.0，霉菌为4.0-5.8，放线菌为7.5-8.5。但微生物在生长代谢过程中，由于营养物质的利用以代谢产物的形式积累，有时会引起pH值的变化，因此为了维持培养基pH值的相对稳定，特殊情况下需要在培养基中加入pH缓冲剂，来调节pH值满足微生物在生长范围内。如在培养基中常用磷酸盐（K2HPO4和KH2PO4）作缓冲剂,因为K2HPO4是碱性，KH2PO4是酸性，当微生物代谢导致酸性物质积累，H+含量增加时，这时的弱碱物质K2HPO4变成了弱酸盐KH2PO4，溶液的pH值降低不大；反之，OH-增加时，这时弱酸盐KH2PO4变成了弱碱盐K2HPO4，溶液的pH值升高不大。

2.3调节培养基的渗透压

微生物的细胞膜是半透膜，在低渗透压的条件下，当外部环境溶液浓度低于细胞内部环境，水分子会由低渗透溶液进入细胞，导致细胞的膨胀甚至破裂；反之，当外部环境溶液浓度高于细胞内部环境，渗透会迫使水从细胞内部扩散出来，导致细胞皱缩，细胞壁与细胞膜分开（质壁分离）。因此，微生物只有在等渗的条件下才能生长。所以在配制培养基的过程中，要控制好各营养物质的浓度大小。通常在培养基中适当加入氯化钠以提高渗透压。

3、培养基的优化方法

既然营养成分、比列、pH值、渗透压都会对微生物生长造成影响，怎样才能达到最佳的组合、满足微生物生长的各项指标？那就需要对培养基进行各种优化，以满足微生物的生长需要。目前实验室常用的有单因素试验法、正交实验设计、响应面优化设计法。

3.1单因素试验法

单因素试验是指因素间假设没有相互作用的前提下，一个实验中只有一个因素在变化，而其它因素保持恒定不变的实验。通过一次改变一个因素的水平而其它因素保持水平不变来确定整个实验中该因素所起的作用，然后一个个因素进行试验的优化方法。但当实验因素较多时，需要多次的试验次数及较长的试验时间，才能完成每个因素的筛选优化，最终确定培养基的成分、条件等。单因素试验法通常是用来确定碳源和氮源以及它们的配比，然后再进行正交试验。但大多数培养基成分都比较复杂，实验因素间经常存在交互作用，不能获得最佳的优化结果。所以培养基的优化试验一般不采用单因素试验法，而采用正交试验设计法。

3.2正交试验法

正交试验法是根据试验的需要，找出试验中具有代表性的多因素，利用一套表格选择多因素、多水平，设计合理的试验，找出它们之间存在的交互作用，寻找最佳因素水平结合，大大减少试验次数，较快地取得实验结果。正交试验法利用的是普通统计分析方法来分析试验结果，对因素的个数没有严格的限制，不管因素之间有无交互作用都可使用。正交试验设计的因素、水平合理，分布均匀，不需要反复试验，误差小、特别是在试验因素、水平很多、因素之间的交互作用很多时，正交试验法具有明显的优势，单因素试验几乎无法完成。比如吴亚丽等人用正交试验通过摇瓶发酵确定了最佳培养基是基因菌株融合蛋白，用这种优化培养基使GST融合蛋白的量提高到1.8g/L,占总蛋白质量的25%。

正交试验法注重的是科学合理地安排试验，但它仍有一定局限性，不能找出全部因素和水平之间的关系，只能是一个大概值，不能准确给出因素和水平的一个最优值。而且试验的次数很多，在试验工作中应用范围还是受到一的定限制。

3.3响应面优化法

响应面优化法是利用数学统计方法找出多因素与响应面之间结合的最佳条件，得出一个数学函数方程，用它对受变量影响的响应面进行建模和分析,将响应面进行优化，通过因素与响应面的函数关系快速建模，减少实验的次数和时间，用最经济的方法和最短的时间全面进行试验研究，准确地找到整个区域内因素与面的函数关系，从而获得较好的实验结果。响应面优化法用回归函数方程式作为估算工具，将多因素实验中因素与响应面的关系，用多项式来近似，使其实验结果函数化，依据函数方程式对整个面进行全面分析，研究因素与响应值之间，因素与因素之间的关系，并进行优化，从而减少实验的工作量。姜丽艳、李雪等人用响应面优化法对乳链菌肽液体发酵培养基的响应区域进行水平的优化，优化后的乳链菌肽效价是优化前的4.48倍。

响应面优化法得到的数据更精确、更全面，哪怕是对试验有显著影响的因素都可以用响应面优化法进行优化。

还有不常用的均匀实验设计法、二次正交旋转组合法、遗传算法与神经网络等几种方法，在培养基优化中都会用到，关键是根据实验的需要，这里就不再一一叙述。

4、结论

综上所述微生物培养基的优化有几个关键因素：（1）培养基成分的确定；（2）培养基的设定；（3）培养基的优化方法。通过三个因素的对比研究，培养基成分是关键，只有先确定成分才能进一步设计培养基的条件，而每一个成分、条件的确定，最大程度满足微生物生长的需要，就需要对培养基进行优化。优化的方法很多，本文只列举了目前用得最多的三种，研究结果表明，最佳方法是响应面优化设计法，其次是正交实验设计法，最后才是单因素试验法。当然随着科学的发展还有更多更好的培养基优化方法，满足微生物培养基分离、纯化、生产的需要。

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