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文题释义：

脂肪源基质血管组分：是指来源于脂肪组织的基质血管组分细胞，它广泛存在于脂肪组织中，主要包含脂肪来源干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞、抗炎细胞、T细胞等混合细胞成分。由于它相对较易获取且对供体不会造成过大的损伤，同时可以避免细胞培养等优点，被认为是干细胞医学良好的细胞来源。

物理方法：酶解法为国际公认的富集基质血管组分的方法，但加入了外源性消化物质，国际上不允许用于临床试验，故使用不加入外源消化物质的物理方法获取基质血管组分即成为了研究的主要方向。

大量研究从脂肪组织中分离得到富含细胞的成分，并将其命名为基质血管组分[1]，通过系列研究证实基质血管组分中的细胞成分具有多细胞系分化能力，血管基质组分包含基质细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、周细胞、免疫细胞以及大量血液循环来源的细胞，比如白细胞、红细胞等，是细胞辅助脂肪移植中最重要的组分[2,3]。研究表明，通过吸脂得到的脂肪组织经过一系列处理，分离纯化得到的细胞成分经过体外培养可以贴壁生长，在合适的条件下这些细胞可以向成骨、成脂、成肌方向分化[4,5,6]；同时基质血管组分细胞能在整形美容、心肌瘢痕、支气管注射治疗、肾病治疗、骨再生等方面发挥重要作用[7,8,9]。基质血管组分来源丰富、取材方便，能直接从脂肪组织中分离，无免疫排斥反应，具有非常好的研究和应用价值[10,11,12,13,14]。

OSINGA等[15]使用类似的机械方法制备脂肪移植材料，但是其过程只改变了脂肪抽出物的宏观结构而不是微观结构，此外没有发现细胞数目、存活性、脂滴数量、血管结构或细胞组成比例的差异。YAO等[16]用推注法破碎大多数成熟的脂肪细胞制备出富含基质血管组分细胞的脂肪组织干细胞凝胶，达到了富集基质血管组分细胞及细胞外基质的目的，其中基质血管组分中含有大量具有生物学活性的脂肪源性干细胞，并且保留了基质血管组分黏附在细胞外基质上的生理关系，使得基质血管组分浓缩的同时，更加容易定植在移植区域[17,18,19]。作者在研究过程中发现普通推注法出现了炎症反应，推测其碎片率可能会偏高，而当前分离脂肪源基质血管组分的方法主要就是酶解法和推注法，酶解法是在实验过程中加入外源性消化酶，在国际上不允许被运用于临床研究，而普通推注法操作繁琐，且利用该方法制得的基质血管组分中细胞碎片率偏高，活细胞率偏低，引发炎症的潜在风险较高，故作者将原有的推注法进行了改良并提出了3种新的制备基质血管组分的物理方法，一种是在原有操作步骤上进行改良后得到的改良推注法，一种是利用玻璃珠破碎制备基质血管组分细胞的方法，还有一种是利用内置式超声波破碎脂肪组织制备基质血管组分细胞的方法[20,21,22,23]。改良推注法运用机械破碎原理破碎脂肪组织中成熟脂肪细胞，富集基质血管组分细胞。基质血管组分细胞中含有大量的、具有超强生命活性的脂肪干细胞及免疫细胞，而脂肪干细胞作为脂肪组织的储备可直接转化为脂肪细胞，并且保留了基质血管组分细胞黏附在细胞外基质上的生理关系，同时改良推注法不加入外源性化学物质，制备过程较为简易、花费成本较低。玻璃珠破碎法(简称玻璃珠法)是利用玻璃珠震荡产生的机械剪切力来破碎成熟脂肪细胞，这种震荡产生的机械剪切力相对于推注来说较小，对目标细胞的损伤较小，很好地保证了基质血管组分细胞的活性，且不会造成太多的细胞碎片[24,25,26,27,28,29,30,31,32,33]。内置式超声波破碎法(简称内置超声波法)利用空化效应产生的空化核对脂肪组织进行破碎，产生的机械力同样对目标细胞损伤较小，保障了目标细胞的细胞活性，同时不会产生过多的细胞碎片，大幅减小了产生炎症的风险。通过比较这几种物理方法，希望寻找到一种更加高活性、安全、简便的制备脂肪源基质血管组分的方法。

1、材料和方法

1.1设计

细胞学体外实验。

1.2时间及地点

实验于2018年1月至2019年1月在华南农业大学生命科学学院广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室完成。

1.3材料

1.3.1脂肪组织

实验所用人体脂肪组织均由广州中家医家庭医生整形美容医院提供，体检无其他疾病，取材前均获知情同意并通过伦理审批，均为脂肪抽吸术所得脂肪颗粒。正常成年人的体质量指数值在18.5-23.9kg/m2之间[26,27]。随机取36位进行脂肪抽吸术患者，均为女性，年龄18-35岁，平均年龄26.8岁，体质量指数值为24.0-32.0kg/m2，平均体质量指数值29.2kg/m2，均属于过重或肥胖。抽吸出大腿部脂肪，每位患者抽吸的脂肪量为200-400mL，平均(308.3±50.6)mL。

1.3.2实验试剂、仪器

0.4%锥虫蓝、乳酸脱氢酶细胞活力检测试剂盒、CCK-8细胞增殖率检测试剂盒(IBL公司)；DMEM培养基、Ⅱ型胶原酶(GIBCO)；玻璃珠(CUSABIO)；细胞计数器(MARIENFELD公司)；涡旋振荡器(Vortex)；手持式超声波细胞粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；小型高速离心机(Eppendorf)；倒置显微镜(OLYMPUS公司)；PI细胞凋亡检测试剂盒、流式细胞仪(BD公司)；CO2培养箱(Termo)；鲁尔接头(ARK)；酶标仪(BIO-RAD)。

1.4实验方法

1.4.1基质血管组分细胞的获取

实验分为6组，分别为阴性对照、酶解法、普通推注法、改良推注法、玻璃珠法和内置超声波法对脂肪组织进行处理以获得基质血管组分细胞，各组3次生物学重复，其中阴性对照为未经任何处理，阳性对照为酶解法。

1.4.2酶解法

将吸脂手术抽取的脂肪组织放入离心机，2000r/min离心1min，脂肪组织分层，将血水推出，过筛(一层筛网，筛孔尺寸：0.425mm，标准目数：40目)。将去除血水后的脂肪组织转移到离心管中，加入等体积的0.2%Ⅱ型胶原酶，来回颠倒混匀，放入37℃培养箱消化60min[28]。

1.4.3普通推注法

将获得的脂肪组织以2000r/min离心1min，将离心后上层油脂回收备用，推出底层血液(最大可能将血液除去)，将中间层高密度脂肪组织用接头转移至1个新的注射器中。用手术剪将脂肪组织剪碎，将含有剪碎后的脂肪组织的螺旋纹注射器与1枚新注射器通过1.4mm的鲁尔接头密封对接，然后推动含有高密度脂肪组织的注射器活塞，将脂肪组织从一侧推入另外一侧的注射器中，连续往返推注，推注速度为10mL/s，时间1min。将之前油脂加入到经过推注破碎的脂肪组织中，混和均匀。最后将上述获得的脂肪组织混合物过滤(2层筛网，40目、60目)[29]。

1.4.4改良推注法

其他步骤同普通推注法(见1.4.3)，但将手术剪剪碎改为过筛(一层筛网，筛孔尺寸：0.425mm，标准目数：40目)。将吸脂手术抽取的脂肪组织放入离心机，2000r/min离心1min，脂肪组织分层，将血水推出，过筛(一层筛网，筛孔尺寸：0.425mm，标准目数：40目)，2个螺纹注射器(10mL)通过1.4mm孔径的转接头连接，将脂肪组织按照10mL/s、1min的推注速度和推注时间，在2个螺纹注射器间连续来回推注。最后将脂肪组织混合物过筛(筛孔尺寸：0.250mm，标准目数：60目)。

1.4.5玻璃珠破碎法

将一定量圆形固态物体(直径为1.0-2.0mm)放入离心管中，高温高压灭菌。将吸脂手术抽取的脂肪组织以2000r/min离心1min，将离心后的底层血液弃去，然后过40目筛网，将滤液转移至放有玻璃珠离心管中，再将离心管放置在涡旋振荡仪上，调节转速至2500r/min，振荡9min，振荡产生剪切力进行破碎[30]。

1.4.6内置式超声波破碎法

将吸脂手术抽取的脂肪颗粒放入离心机，2000r/min离心1min，脂肪颗粒分层，将血水推出，超声探头置于去除血水后的脂肪颗粒中，经过反复多次实验最终确定最佳处理功率与时间，以25W的功率对脂肪颗粒处理36s，超声波在脂肪组织中产生空化作用对脂肪细胞进行破碎[31]。

1.4.7基质血管组分细胞的收集

(1)酶解法获得的基质血管组分细胞的收集：将在37℃消化60min的脂肪颗粒放入低速离心机，2000r/min离心10min，离心后分3层，上层为油脂或部分未消化完全的脂肪混合物，中间层为完全培养液，下层为基质血管组分细胞沉淀，弃掉上层和中层，加入DMEM完全培养液重悬细胞沉淀，过200目细胞筛，收集滤液，收集到的滤液即为含有高度浓缩的富含脂肪干细胞的基质血管组分细胞[32]。

(2)5种物理方法获得的基质血管组分细胞的收集：将处理后的脂肪颗粒2000r/min离心5min，在油层下的物质即为含有高度浓缩的基质血管组分细胞。取500μL移植材料加入500μLDMEM进行混合后2000r/min离心5min，下层的细胞沉淀即为基质血管组分，弃上层物质，向细胞沉淀加入500μLDMEM进行重悬，制成细胞悬液。普通推注法在进行上述步骤前应先将过滤后混合物转入密封的注射器中，加上塞子，拉开注射器栓，使注射器内呈现负压，轻轻震荡注射器后再进行离心。

1.5主要观察指标

1.5.1细胞形态学

将原始的脂肪颗粒和取得的细胞悬液分别涂布于载玻片上，在倒置显微镜下对成熟的脂肪细胞和基质血管组分细胞的形态及大小进行观察。

1.5.2细胞存活率

向90μL细胞悬液中加入10μL0.4%锥虫蓝，吹打混匀后加入细胞计数器，在倒置显微镜下进行计数，染上蓝色的细胞即为死细胞，无色的即为活细胞。计数方法：分别计数5个中方格的总细胞数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以16×104，即为总细胞数。以相同的方法计算活细胞数，活细胞数除以总细胞数即为细胞的存活率[33,34]。

1.5.3细胞增殖率

首先将各个样品稀释至相同细胞浓度(1×108L-1)，然后在96孔板中用DMEM/F12(含体积分数为2%胎牛血清)配置100μL细胞悬液。将96孔板在培养箱预培养48h(在37℃，体积分数为5%CO2条件下)，每孔加入10μLCCK-8溶液，在培养箱内孵育1-4h，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。

1.5.4细胞活性

将各个样品稀释至相同细胞浓度(约1×108L-1)，以每孔100μL接种至96孔板，第1个孔为无细胞的DMEM培养液(背景空白对照孔)，之后为不同实验样品的细胞孔(样品孔)，加入LDH释放试剂，加入量为原有细胞悬液体积的10%，反复吹打混匀，然后在细胞培养箱中孵育1h，最后每孔加入60μLLDH工作液，混匀，室温避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)，酶标仪测定450nm处吸光度值。

1.5.5细胞碎片及凋亡率

将上述制得的细胞悬液2000r/min离心5min，收集沉淀；用PBS漂洗细胞2次，并进行细胞计数，1500r/min离心5min，收集细胞(1×108L-1)；加入500μLPBS重悬细胞沉淀；加入5μLPropidiumIodide混匀，室温避光反应10min;1200r/min离心5min,500μLPBS重悬细胞沉淀，重复2次：最后用流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞碎片率[35,36]。

1.6统计学分析

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，所有数据均用表示，采用单因素方差分析用于多组间或两两比较，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1细胞形态学

将脂肪颗粒直接涂布后在倒置显微镜下进行观察，成熟的脂肪细胞以单个或成群的形式存在于人体内，其体积与大部分细胞相比较大，有50-150μL，其大小与人体的肥胖程度呈正相关，一般为圆形或与周围细胞挤压后呈多边形，见图1，细胞中央有一大滴脂滴，胞质呈薄层，位于细胞周缘，包绕脂滴，核扁，被挤压至边缘。

图1人成熟脂肪细胞的形态

图注：图中A为人体成熟脂肪细胞(×10);B为人体成熟脂肪细胞(×40)

将用完全培养液重悬的含有基质血管组分细胞的细胞悬液进行涂布，在倒置显微镜下进行观察，见图2。将酶解法、改良推注法、玻璃珠法及内置超声波法收集到的基质血管组分细胞的大小进行比较，总的细胞大小均值为5.19μm，酶解法细胞大小为(5.22±0.26)μm，改良推注法细胞大小为(5.11±0.34)μm，玻璃珠法细胞大小为(5.24±0.19)μm，内置超声波法细胞大小为(5.20±0.17)μm，普通推注法细胞大小为(5.21±0.29)μm，阴性对照细胞大小为(5.18±0.24)μm,5组相比差异无显著性意义(P>0.05)。

图2人基质血管组分细胞形态(×40)

图注：图中A为酶解法；B为改良推注法；C为玻璃珠法；D为普通推注法；E为内置超声波法；F为阴性对照

2.2细胞存活率

见图3。玻璃珠法细胞存活率为(75.26±1.94)%，内置超声波法细胞存活率为(76.25±0.98)%，而普通推注法和改良推注法细胞存活率分别为(58.34±1.15)%、(64.33±2.44)%，略低于玻璃珠法。酶解法细胞存活率均值最高且与阴性对照相差不大，为(94.24±2.63)%，其中普通推注法、改良推注法、玻璃珠法、内置式超声波与阴性对照及酶解法相比差异有显著性意义(P<0.05)，玻璃珠法和内置超声波法细胞存活率与普通推注法和改良推注法相比差异也有显著性意义(P<0.05)。

图3各组基质血管组分细胞存活率

图注：与阴性对照相比，aP<0.05；与酶解法相比，bP<0.05；与普通推注法相比，cP<0.05

2.3细胞增殖率

酶解法、改良推注法、普通推注法、玻璃珠法、内置超声波法、阴性对照组的细胞增殖率分别为0.036±0.005,0.021±0.005,0.024±0.004,0.035±0.003,0.032±0.004,0.032±0.003。酶解法因为无机械压力的原因增殖率最高，而玻璃珠法收集到的基质血管组分细胞比酶解法收集到的略低，普通推注法最低。普通推注法和改良推注法与阴性对照及酶解法相比差异有显著性意义(P<0.05)，玻璃珠法和内置超声波法与普通推注法相比差异也有显著性意义(P<0.05)。

2.4细胞活性

阴性对照由于没有经过任何处理，细胞量极低，故细胞活性也最低，为0.203±0.018。酶解法由于没有机械压力所以细胞活性最高，为0.959±0.016。玻璃珠法细胞活性为0.868±0.021，内置超声波法细胞活性为0.861±0.025，改良推注法细胞活性为0.651±0.011，普通推注法细胞活性为0.583±0.013，玻璃珠法及内置超声波法的细胞活性相差不大，与酶解法相比略低，但差异无显著性意义(P>0.05)，而改良推注法和普通推注法与酶解法、玻璃珠法、内置超声波法相比细胞活性更低，差异有显著性意义(P<0.05),5种方法与阴性对照相比差异有非常显著性意义(P<0.01)。

2.5细胞碎片率及凋亡率

采用流式细胞仪进行检测，见图4，由结果可以看到酶解法、玻璃珠法、内置超声波法、改良推注法、普通推注法收集到的基质血管组分细胞中碎片比例分别为(2.35±1.48)%,(7.85±4.43)%,(10.63±4.37)%,(24.49±4.65)%,(35.51±4.23)%，酶解法碎片比例略低于玻璃珠法，但差异无显著性意义(P>0.05)。酶解法、玻璃珠法及内置超声波法细胞碎片比例要远远低于普通推注法和改良推注法，差异有显著性意义(P<0.05)，见图5。

图4流式细胞仪检测细胞碎片率和活细胞率

图注：图中A为普通推注法；B为改良推注法；C为内置式超声波法；D为酶解法；E为玻璃珠破碎法；F为阴性对照

图5各组基质血管组分细胞碎片率

图注：与阴性对照相比，aP<0.05；与酶解法相比，bP<0.05；与普通推注法相比，cP<0.05

酶解法的细胞凋亡率极低，为(0.019±0.011)%，普通推注法的细胞凋亡率较高，为(6.87±2.56)%，改良推注法、玻璃珠法、内置超声波法的细胞凋亡率分别为(4.79±2.35)%,(0.051±0.032)%,(0.092±0.029)%，玻璃珠法和内置超声波法的细胞凋亡率略高于酶解法，但差异无显著性意义(P>0.05)，而普通推注法和改良推注法的细胞凋亡率远高于玻璃珠法、内置超声波法和酶解法，差异有非常显著性意义(P<0.01)，见图6。

图6各组基质血管组分细胞凋亡率

图注：与阴性对照相比，aP<0.05；与酶解法相比，bP<0.05；与普通推注法相比，cP<0.05

3、讨论

干细胞是一种能够长期存活、具有不断自我增殖能力和多向分化潜能且几乎存在于所有组织中的原始细胞，为多种临床疾病的治疗提供了新的思路[37]。大量研究从脂肪组织中分离得到富含细胞的成分，并将其命名为基质血管组分，通过系列研究证实基质血管组分中的细胞成分具有多细胞系分化能力，除了含有特定成脂的前脂肪细胞外，还存在着具有多向分化能力的干细胞。脂肪组织是脂肪干细胞的重要来源[38,39]。脂肪组织可以在吸脂或切脂减肥的瘦身者中获取，而且过程易于患者所接受；同时脂肪组织取材量充足，展现出广阔的临床应用前景，脂肪组织中的多功能干细胞被称之为脂肪源性干细胞，具有较强的自我更新能力、分离培养较为容易、增殖较快、全能性较高，已经成为干细胞治疗领域的热点，在组织重建与修复中展现出良好的应用前景[40,41,42,43]。

当前，分离基质血管组分细胞的方法主要是酶解法,同时还有部分其他物理方法，如推注法、研磨机研磨法、体外冲击波法、超声波结合低温研磨法等。酶解法加入了外源性消化酶，存在安全性问题，故在国际上不允许被应用于临床，且酶解法需要使用Ⅱ型胶原酶，费用较高，实验条件要求较为严苛，需要在特定条件下进行，真正应用于临床的价值不高[44,45]。YAO等[16]提出的推注法是一种利用机械破碎原理对脂肪组织进行破碎进而收集基质血管组分细胞的方法，但收集到的基质血管组分中细胞碎片率较高，引起炎症的风险较高，且在分离过程中使用手术剪对脂肪组织进行剪碎增大了污染的风险，不利于后续在临床上应用。而MENZI等[46]设计的研磨机研磨法是通过市售的手动肉类研磨机对脂肪组织进行破碎收集基质血管组分细胞的方法，同样存在着因产生的机械力过大导致细胞活性低、细胞碎片率太高容易引发炎症而影响临床应用的问题。PRIGLINGER等[47]提出的体外冲击波法，尽管收集到的细胞活力较高，对基质血管组分细胞的增殖分化也没有很大影响，但在分离过程中还是不可避免的使用了胶原酶，且该方法对基质血管组分细胞的富集作用并不明显，同时使用该方法成本较大，很多实验室缺乏相应设备，很难在实际操作中被广泛应用。SCHENDEL等[48,49]利用外置式的超声波加上低温研磨对脂肪组织进行处理以收集基质血管组分细胞，最终收集到的基质血管组分细胞与脂肪细胞释放出的油脂难以分离，过多的油滴同样很容易导致炎症产生，且该方法得到的基质血管组分细胞活性并不高。因此希望能得到更简便且能广泛应用，细胞活性更高，细胞碎片率及细胞凋亡率更低，且不影响后续细胞增殖的收集基质血管组分细胞的方法。作者在原有推注法的基础上进行了改良，首先通过40目筛网提供原始剪切力，减低了原有推注法使用手术剪剪开脂肪组织易造成污染的风险，同时不需要利用油脂对脂肪组织进行萃取的方法收集基质血管组分，而是采用了多次过筛后离心结合过滤这样更加柔和的物理方式进行处理，减小了对细胞活性的影响，使实验步骤更加简便，且减少了操作成本，使原有推注法更加适用于临床应用。虽然改良后的推注法细胞活性有所提升、细胞碎片率有所降低，但仍希望能得到更优的方案，进而作者提出了2种利用更柔和的物理力高效富集基质血管组分细胞材料的物理方法——玻璃珠震荡破碎和内置式超声波破碎富集基质血管组分细胞，利用玻璃珠震荡产生的机械剪切力或超声波产生的空化作用来破碎成熟脂肪细胞，震荡产生的机械剪切力或超声波产生的空化作用相对于推注来说较小，对目标细胞的损伤较小，故而比改良后的推注法更具有临床应用价值。

通过研究发现，改良推注法从生物活性、细胞碎片率、细胞凋亡率、细胞增殖率、细胞存活率等多方面比常规推注法取得了更佳的效果，而相对于改良推注法，玻璃珠法和内置超声波法富集基质血管组分细胞能够更加快捷、方便，利于制备出生物学性质更加优良高度浓缩的脂肪来源干细胞和细胞外基质材料；与酶解法相比，运用机械挤压原理，将脂肪组织中大多数成熟脂肪细胞破碎，不添加外源性化学物质，作为干细胞疗法有更广阔的临床应用前景。玻璃珠法在处理过程中加入了外源物进行处理，这将增加移植处感染炎症的风险，而内置式超声法未加入外源性化学物质也没有在处理过程中加入外源物进行处理。总的来说作者认为内置超声波法和玻璃珠法优于普通推注法及改良推注法，其将在干细胞疗法方面展现出更加广阔的前景。

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基金:国家级大学生创新创业训练计划(201810564021),项目负责人:卢沛伶;广东省自然科学基金(2018A030313625),项目负责人:张玲华.