造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新能力和分化成各类成熟血细胞的潜能[1]。因此，已被广泛应用于临床HSC移植，并且是基因治疗最有前景的靶细胞[2,3]。异基因骨髓和动员的外周血是目前临床HSC移植的主要干细胞来源，然而约30%-40%的患者缺乏人类白细胞主要抗原相匹配的供者，因此，错失了移植时机。HLA单倍体相合移植可使90%以上的患者获得HSC移植机会，但是存在移植后移植物抗宿主病发生率高、造血重建延迟、移植后严重感染的发生率高等不足。近年来，脐带血为缺乏HLA匹配的外周血或骨髓移植的患者提供了HSC替代来源[4]。然而，由于UCB移植物中HSC的数量有限，导致了中性粒细胞植入延迟，增加了早期感染风险和移植相关死亡率[5]。因此，如何在体外有效扩增HSC的数量是HSC临床应用亟待解决的问题。此外，HSC体外扩增体系的建立，也将有望解决HSC基因治疗遗传性疾病的技术瓶颈。近几年来，随着对HSC概念认识的不断提高以及对调控HSC自我更新和分化之间平衡的分子机制的深入研究，学者们探索了多种体外扩增HSC的方法，以解决临床应用中HSC数量不足这一难题。因此，本文就HSC概念的更新及体外扩增策略的最新研究进展作一综述。

HSC的定义

随着条形码技术、体内追踪细胞发育、单细胞测序以及高分辨率活细胞成像等新技术的发展，HSC的概念不断被更新、表型也不断被精细化定义、造血发育模式被重新修订[6,7,8]。传统观点认为HSC的分化是一个逐级发生的过程，直到最近，Yamamoto等[9]结合近几年的研究结果对HSC的概念和造血发育模式进行了重新修订，即HSC向多能祖细胞分化不是产生谱系限制性祖细胞的唯一途径，HSC可以直接产生髓系限制性干细胞，进而分化为髓系限制性再生祖细胞或者直接分化为MyRP，通过髓系旁路途径（Myeloid-bypass）最终分化为成熟血细胞。此外，基于连续移植到二次移植受鼠体内的能力将“干细胞”的使用局限于那些具有真正自我更新能力的HSC和MySC；而短期HSC或MyRP即使具有多向分化的能力，但不能进行体内连续移植，被称为“再生祖细胞”[9]。HSC概念和造血发育模式的更新对进一步深入理解HSC的生物学特性，阐明HSC自我更新和分化的分子机制具有重要的意义。

HSC是一个异质性的群体，不同种属、不同等级的HSC具有不同的表型。在人类，CD34+CD38-细胞代表经典的造血干/祖细胞。后来，通过体外实验和异种移植体内实验证实Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞中含有能够成功进行小鼠二次移植的HSC，认为CD90是HSC的表面标记[10]。随后的研究发现，CD49f是HSC的一种特异性标志[11]。也有研究认为，CD34、CD38、CD45RA、CD90、CD49f这些抗原评价HSC在体外的活性是不可行的，因为细胞在体外培养过程中这些抗原的表达发生了显著改变[12]。该研究还发现，内皮蛋白C受体可作为扩增的人长期HSC(long-termHSC,LT-HSC）的1个可靠标志物，并且与培养条件和持续时间无关，EPCR+细胞具有广泛的自我更新潜能[12]。目前，评估体外扩增的LT-HSC的活性仍然依赖于免疫缺陷小鼠移植实验，因此，鉴定出表达水平与HSC再生能力相关的表面分子是研究HSC的关键所在。

HSC体外扩增策略

小分子化合物

近几年，随着高通量筛选技术的发展，多种小分子物质已被尝试用于人HSC的体外扩增，且越来越多的研究证实了小分子化合物能够通过促进HSC自我更新、延迟分化、增加归巢和抑制HSC凋亡明显改善HSC的扩增效果[13]。

Stemregenin1(SR1)SR1是2010年筛选出的一种嘌呤衍生物，在细胞因子（TPO、SCF、Flt3-L和IL-6各100ng/ml）存在的条件下培养5周能够使脐带血CD34+细胞的扩增倍数比对照组增加约50倍，使SCID再植细胞（SRC）增加17倍。机制研究表明，SR1诱导的CD34+细胞扩增是通过直接结合和抑制芳香烃受体（AHR）介导的。但是，SR1仅仅影响了人HSC而对小鼠HSC无影响，这表明，SR1对HSC的作用具有物种选择性[14]。Wang等[15]筛选出了1组最佳的体外扩增方案，即细胞因子（40ng/mlTPO、100ng/mlSCF、100ng/mlFlt3-L和50ng/mlIL-6）联合3种小分子（SR1、VPA和C433）方案，该方案可以使HSC扩增约28倍，并且在免疫缺陷小鼠体内证实了扩增后的细胞具有长期植入和多向分化能力。经该方案扩增后，维持HSC“干性”的功能基因和转录因子表达水平上调，Notch通路关键基因以及靶基因表达水平也上调，Wnt通路靶基因表达水平下调。Ⅰ/Ⅱ期临床试验结果显示，SR1联合细胞因子（TPO、SCF、Flt3-L和IL-6各50ng/ml）在体外培养15d，使CD34+细胞扩增了330倍，并且中性粒细胞和血小板的植入速度明显比接受未经处理的UCB移植的患者显著加快，住院时间显著缩短，且没有伴随GVHD或移植相关毒性的增加[16]。这表明，SR1可作为UCB来源HSC的一种安全有效的扩增剂。

UM171UM171是2014年经高通量筛选出的一种嘧啶吲哚类衍生物。脐带血CD34+细胞经UM171联合细胞因子（50ng/mlTPO、100ng/mlSCF和100ng/mlFlt3-L）培养12d能够使CD34+CD38-CD45RA-CD90+细胞扩增100倍、CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49+细胞扩增约200倍，使SRC扩增13倍[17]。UM171对更原始表型的CD34+-CD45RA-细胞扩增效果较SR1更明显，而SR1对相对成熟表型的CD34+CD45RA+细胞扩增效果更好。机制研究表明，SR1能够导致AhR靶基因的下调。然而，UM171明显抑制了与红系和巨核系分化相关的转录因子的表达。这表明，SR1与UM171促进CD34+细胞扩增的机制不同[17]。Psatha等[18]采用SR1、UM171和LY2228820(Ly）单独或联合扩增健康供者动员的外周血CD34+细胞，结果发现，UM171较SR1或Ly扩增的HSC细胞倍数增多，SR1与Ly联合扩增的效果与单独UM171相似，SR1、UM171和Ly3种小分子联合培养具有显著的叠加作用。然而，动物体内实验表明，SR1+Ly组比UM171组具有更好的植入率，SR1+Ly+UM171联合培养并没有比SR1+Ly组进一步改善植入情况，这可能是因为扩增的HSC本质上的不同或者是伴随了非HSC。最新研究发现，经UM171扩增的脐带血CD34+细胞中调节转化生长因子β（transforminggrowthfactor-β，TGF-β）信号通路的蛋白TGF-βRⅠ、Smad3、p-Smad3、Smad4的表达水平显著提高。这提示，UM171扩增脐血HSC时可能激活了TGF-β信号通路[19]。总之，目前体外实验和动物体内研究表明，UM171不仅能够有效扩增HSC的数量而且能够维持其自我更新能力。然而，UM171扩增HSC的机制仍不明确，并且缺乏相关的临床试验验证其在人体内的有效性及安全性。因此，进一步明确其作用机制及靶点，有望使UM171体外扩增的HSC成功应用于临床HSCT。

表观遗传学修饰剂

研究证实，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和DNA甲基转移酶（DNMT）小分子抑制剂能够有效促进HSC的扩增。在最近的一项研究中，来源于健康供者动员的外周血CD34+细胞经HDAC抑制剂丙戊酸在体外培养5d，使CD34+细胞扩增了约80倍，并且增加了CD34+细胞与间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）之间的黏附性，然而降低了SDF-1/CXCR4的介导的迁移能力[20]。在细胞因子（TPO、SCF、Flt3-L各100ng/ml,IL-350ng/ml）存在下将DNMT抑制剂地西他滨（5azaD）和HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA）依次加入动员的外周血CD34+细胞中培养9d,CD34+CD90+细胞扩增了约3.6倍，并且参与HSC自我更新的转录因子表达水平明显升高，动物实验证实，5azaD/TSA扩增的细胞保持了体内造血植入的能力[21]。因此，对于临床上外周血动员失败的自体造血干细胞移植患者，该策略可能有助于增加HSC的数量。研究报道，特异性抑制HDAC5能够高度上调人脐带血HSC和HPC中CXCR4的表达，增强SDF-1/CXCR4介导的趋化性和归巢能力，并且促进了HSC的长期植入和自我更新[22]。然而，Lam等[23]研究发现,HDAC抑制剂TSA和丙戊酸在扩增脐带血HSPC的同时诱导了白血病相关基因的异常表达。因此，应用表观遗传修饰剂体外扩增HSC的临床应用仍需谨慎，需要进一步的临床前研究验证其安全性。

尼克酰胺

NAM是维生素B3的酰胺化合物，与细胞因子共培养能够延迟UCB来源的CD34+细胞分化，增加CD34+CD38-细胞的比例。用NAM培养的CD34+细胞表现为向SDF-1迁移增加并且以更高的功效归巢于骨髓促进植入，进一步研究发现，NAM通过抑制了SIRT1去乙酰化酶从而抑制HSC分化且改善归巢[24]。在一项Ⅰ期临床试验中，11例患者接受了双份UCB移植，其中1份是由含NAM和细胞因子培养体系体外扩增的脐带血产品（NiCord），另1份为未经处理的UCB。结果显示，接受该方案移植的患者中性粒细胞恢复的时间较历史对照组显著缩短，1年的总生存率和无进展生存率分别为82%和73%，并且无不良事件发生[25]。为了进一步评估快速的中性粒细胞恢复对移植后100d内感染事件和住院时间的影响，随后该研究组对扩大队列研究中18例接受NiCord移植以及86例接受标准UCB移植的患者进行了回顾性分析。结果表明，与标准UCB移植相比，接受NiCord移植的患者中性粒细胞植入更快，总体和细菌感染发生率更低以及住院治疗时间更短[26]。最近，该研究组又接着报道了1项接受NAM扩增的单份脐带血移植的36例患者的临床试验结果，移植后d42中性粒细胞植入的累积发生率为94%，中性粒细胞恢复的时间比采用标准UCB移植的患者缩短了9.5d，血小板恢复的时间缩短了12d,100d时2-4级、3-4级急性GVHD的累积发生率分别为44%、11%,2年时慢性GVHD的累积发生率为40%,2年非复发和复发死亡率分别为24%和33%。该实验明确了体外扩增的UCB作为独立移植物的可行性、安全性和有效性[27]。

铜螯合剂

有研究报道了铜螯合剂能够调节HSPC的自我更新与分化，当铜螯合剂四乙烯五胺与骨髓来源的MSC共培养时，能够明显扩增脐带血CD34+细胞，并且可以增加集落形成单位的数量[28]。最近的一项大样本临床实验报道了101例接受TEPA扩增的单份UCB移植以及295例接受双份UCB移植患者的结果，TEPA处理使CD34+细胞扩增了77倍，2组中性粒细胞植入的中位时间分别为21和28d、血小板植入的中位时间分别为54和105d,2组的急性和慢性GVHD发生率无明显差异，100d生存率分别为84.2%和74.6%[29]。这表明，经TEPA体外扩增的HSPC能够促进中性粒细胞和血小板植入，提高移植后生存率，但是长期有效性与安全性仍需进一步观察。

除此之外，最近筛选出的小分子化合物C7(1种p38-MAPK抑制剂SB203580的类似物）以及JNK-IN-8(1种JNK信号通路抑制剂）也被证实了在体外能够有效促进HSC的体外扩增，并且通过小鼠连续移植实验验证了扩增后HSC的自我更新能力[30,31]。另外，研究还表明，多个小分子组合也是HSC体外扩增的一种新的策略[32]。宋赫楠等[33]建立的单个人HSC体外培养体系和验证小分子化合物作用的方法，更为小分子化合物的筛选提供了可靠的平台和研究基础。因此，小分子化合物被认为是最具有潜在临床应用前景的HSC体外扩增工具，但仍需多中心、大样本的临床实验进一步验证其安全性与有效性。

模拟HSC骨髓微环境

与基质细胞共培养

越来越多的研究表明骨髓“龛”在HSC的静止、自我更新、分化、凋亡、迁移等方面发挥了重要作用[34]。HSC与基质细胞共培养，目的在于模拟内在的造血“龛”。有研究表明，MSC与脐带血CD34+细胞共培养可以明显促进HSC扩增，并且不影响红系的分化能力[35]。在低氧（5%O2）条件下骨髓MSC不仅可以促进HSC扩增也增强了HSC的归巢能力，从而更好地模拟了骨髓微环境[36]。本研究

组前期研究结果显示，脐带血MSC作为细胞滋养层可提高CD34+细胞体外扩增效果，UM171在扩增过程中可较好的保持细胞干性，MSC联合UM171对脐带血CD34+细胞的扩增效果更优[37]。Ⅰ期临床试验结果显示，与双份未处理的脐带血相比，MSC扩增的脐带血与未处理的单份脐带血相结合促进了中性粒细胞和血小板的重建，显著改善了植入。这提示，间充质基质细胞扩增的脐带血移植可能是安全有效的[38]。

氧浓度

氧浓度是参与造血细胞发育微环境中的最主要的因素。骨髓中氧水平的变化范围是1%-6%。氧含量低的区域含有静息的HSC，然而增殖的HSC位于氧浓度高的区域[39]。动物实验研究证实，低氧环境能够降低活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生，促进Lin-c-kit+Sca-1+骨髓HSC的扩增和归巢黏附分子的表达，从而更好地维持了HSC的迁移能力[40]。脐带血CD34+细胞与骨髓MSC在2%、5%、10%和21%O2浓度下共培养，可以分别使CD34+细胞扩增25、60、92和64倍，并且10%O2浓度扩增的CD34+CD90+细胞的倍数最高[41]。在低氧（1%O2）条件下加入睾酮能够促进脐带血HSC扩增，促使CD34+细胞分化为CD34+CD38+CD71+红系祖细胞，并且增加了造血相关基因的表达[42]。细胞对缺氧的反应主要由低氧诱导因子（Hypoxiainduciblefactor,HIF)-1α和HIF-2α介导，HIF-1α和HIF-2α可以通过调节下游的Notch信号调控生血内皮细胞和HSC的生成[43]。在斑马鱼胚胎造血模型中的研究发现，HIF-1α诱导了血小板衍生生长因子B(PDGF-B）信号上调，并且通过活化IL-6/IL-6R通路调控了HSPC的产生[44]。这表明，HIF-1α和HIF-2α介导的低氧调控对HSC的维持具有重要作用。然而，也有研究认为，尽管骨髓微环境具有低氧特性，但HIF-1α和HIF-2α对HSC的自我更新、长期造血重建和造血功能的维持是非必需的[45,46]。因此，目前研究中关于HIF在HSC功能维持中的作用这一观点仍是矛盾的，有待进一步研究明确。

HSC的代谢调节

HSC的代谢调控是近几年HSC领域新兴的研究热点之一。调节HSC的代谢途径、线粒体功能和能量需求对维持HSC的功能至关重要[47,48,49]。Guo等[50]通过高通量筛选技术鉴定出1种核激素受体PPARγ的拮抗剂——GW9662，能够通过增强糖酵解促进人CBHSC的体外扩增和功能性HSC的长期植入。因此，通过驱动葡萄糖代谢可能是促进HSC体外扩增的一种新策略。线粒体对能量的生成是必不可少的。Qian等[51]的研究发现Dlk1Gtl2基因座能够通过抑制PI3K-mTOR通路限制线粒体代谢来维持LT-HSC的功能，进一步证实了线粒体代谢状态在HSC功能维持中的重要作用。随后的研究也证实采用线粒体绿色荧光探针测量线粒体含量，会因为染料外排而导致HSC中荧光强度人为降低。该研究中采用线粒体DNA定量、线粒体核计数以及遗传编码的线粒体报告基因的荧光强度三种检测方法同时证实了HSC和MPP比谱系定向的祖细胞和成熟细胞具有更高的线粒体质量[52]。鉴于上述结果的不一致性，可能需要进一步的研究重新审视线粒体在HSC生物学中的作用。但这些结果仍能说明调节HSC代谢和线粒体功能可能是HSC体外扩增的新靶点。

基于生物材料的HSC体外扩增

目前很多研究采用2D（纳米材料、表面涂层）和3D（多孔支架、水凝胶封装系统）平台尝试体外扩增HSC[53]。Mousavi等[54]研究发现在涂有纤连蛋白的3DPCL纳米支架中体外扩增的CBCD34+细胞数量比2D细胞培养更多，并且归巢相关基因和自我更新相关基因的表达也较2D细胞培养和扩增前均显著升高。这表明，涂有纤连蛋白的3DPCL纳米支架可以更好地维持扩增后CBHSC的归巢和自我更新，基于3D生物材料的BM模拟“龛”是一种具有潜在应用前景的体外扩增策略。目前虽然已经通过基于2D或3D生物材料的平台进行了HSC体外扩增的若干研究，但是还需要进一步研究以建立合适的生物材料平台用于临床相关HSC的体外培养和扩增。

为了增加移植物中的细胞数量，目前已经建立了多种HSC体外扩增策略，但尚未发现在体外诱导HSC强力扩增的最佳体系。然而，近几年研究表明开发最佳的HSC体外扩增技术可能涉及多种方法协同作用，包括添加细胞因子/小分子化合物、调节HSC代谢、体外模拟骨髓微环境以及3D生物材料的应用等。此外，明确HSC最佳扩增条件的困难部分是由于对调控HSC命运的分子机制的理解不充分。因此，进一步阐明促进HSC自我更新、改善HSC归巢并且抑制其凋亡的分子机制有望为探索新的体外扩增方法提供科学理论依据。

参考文献：

[19]徐诗琪，丁亚辉，张宇，等.UM171体外扩增脐血造血干细胞的机制.中国组织工程研究,2018;22(21):3328-3334.

文瑞婷,张斌,陈虎.造血干细胞体外扩增策略研究进展[J].中国实验血液学杂志,2020,28(03):1038-1043.

基金：北京市科技计划干细胞与再生医学研究项目(Z181100001818004);北京市科技计划首都临床特色应用研究与成果推广项目(Z161100000516184).