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探讨SIRT1对干细胞成软骨、成骨分化的调控作用及机制

2020-07-15 323 上传者：管理员

摘要：目的探讨SIRT1对干细胞成软骨、成骨分化的调控作用及机制。方法C3H10T1/2感染腺病毒Ad-SIRT1后于普通培养基培养,通过荧光显微镜了解腺病感染情况,采用Westernblot验证目的蛋白是否高表达;在不同时间点,通过Westernblot、阿尔新蓝染色、碱性磷酸酶染色检测干细胞成骨、成软骨分化关键转录调控因子及相关分化标志物的表达情况;使用XAV-939抑制β-catenin信号后,再利用Westernblot检测成骨、成软骨分化标志物表达情况。结果C3H10T1/2感染腺病毒Ad-SIRT1后,SIRT1获得高表达;在诱导分化后第5、7、9天,Ad-SIRT1组成软骨分化的标志物Ⅱ型胶原、蛋白多糖,以及成骨分化的标志物Ⅰ型胶原、骨钙素较Ad-GFP组明显增加(P<0.05);阿尔新蓝染色结果发现Ad-SIRT1组软骨细胞外基质分泌较Ad-GFP组明显增加;碱性磷酸酶染色结果发现Ad-SIRT1组部分细胞着色为阳性,而Ad-GFP组无明显着色的细胞;同时发现诱导分化后的第3、5天,Ad-SIRT1组中成软骨、成骨分化关键转录调控因子Sox9、Runx2的表达较Ad-GFP组明显增加(P<0.05);Ad-SIRT1组与Ad-GFP组比较,β-catenin乙酰化水平明显降低(P<0.05),而抑制β-catenin信号后,与Ad-SIRT1组比较,Ad-SIRT1+XAV-939组干细胞成软骨及成骨分化标志物表达明显降低(P<0.05)。结论SIRT1能够通过β-catenin信号促进干细胞的成软骨及成骨分化。

关键词：
干细胞
成软骨分化
成骨分化
细胞学
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干细胞因具有多向分化潜能及体外容易扩增等优势,被认为是组织工程骨、软骨极具潜能的种子细胞[1]。经研究发现老年鼠的干细胞成骨、成软骨、成脂、成肌分化能力明显较弱[2]。此外,大量研究认为骨关节炎、骨质疏松、皮下脂肪减少等老年退变性改变都与干细胞分化能力减弱有关[3,4,5]。年轻小鼠的干细胞移植到老年鼠体内后,明显延缓了老年小鼠的衰老,延长了其寿命。此外还有研究发现衰老不但导致干细胞分化能力减弱,干细胞的分化倾向也明显改变,包括成骨分化减弱,而成脂分化相对增强等[6]。从这些研究都可以看出衰老对干细胞分化潜能及定向分化方面有重要的影响。因此,不难判断参与调控的衰老相关基因在干细胞分化过程中有重要的作用。

SIRT1是一种去乙酰化酶,在细胞分化、增殖、凋亡、细胞衰老等调控中有着重要的作用。随着体外细胞传代次数的增加,SIRT1的表达呈现明显降低的趋势[7,8]。SIRT1表达及活性随着年龄的增加而逐渐降低,并且与干细胞分化潜能呈现明显的相关性[9],提示SIRT1在干细胞分化中有重要的作用。尽管目前有研究提示SIRT1能够增强干细胞骨向分化的作用[10,11],但尚无SIRT1在调控干细胞成软骨、成骨分化中生物学功能的研究。因此,本研究主要探讨在无其他诱导因子存在条件下,SIRT1对干细胞成软骨、成骨分化作用及机制。

1、材料与方法

1.1细胞培养与病毒构建

HEK-293(人胚胎肾细胞系)、C3H10T1/2(小鼠胚胎来源的间充质干细胞)购自美国ATCC公司。细胞采用包含10%的胎牛血清及1%双抗的完全培养基培养(DMEM购于HyClone公司;胎牛血清购于BiologicalIndustries公司;双抗购于碧云天公司)。细胞培养在5%CO2细胞培养箱中。细胞培养过程中,细胞融合至85%左右进行细胞传代。腺病毒Ad-SIRT1(人源性,1879bp)及空载对照病毒Ad-GFP购自汉恒生物,本研究在HEK-293细胞中进行了腺病毒的扩增,在目的C3H10T1/2细胞中进行表达鉴定。XAV-939为β-catenin信号小分子抑制剂,能够特异性促进β-catenin的降解(购自MedChemExpress公司),培养基终末浓度为10μmol/L。

1.2Westernblot检测蛋白表达情况

C3H10T1/2培养在6孔板中,分为3组:空白组(Control组)、Ad-GFP组、Ad-SIRT1组。感染腺病毒后2h更换培养基,此后隔日更换培养基,感染病毒后3、5、7、9d分别收集总蛋白。细胞裂解液(购于碧云天公司)裂解细胞后离心,收集总蛋白,测量蛋白浓度,加入上样缓冲液,热变性后保存。电泳分离、转膜、5%脱脂奶粉封闭,孵育一抗anti-SIRT1(购自美国Abcam,1∶1000)、anti-Sox9(购自美国Abcam,1∶1000)、anti-Col2A1(购自美国Immunoway,1∶500)、anti-aggrecan(购自美国SantaCruzBiotechnology,1∶500)、anti-Runx2(购自美国AffinityBiosciences,1∶500)、anti-Col1A1(购自美国AffinityBiosciences,1∶1000)、anti-osteocalcin(购自美国AffinityBiosciences,1∶500)、anti-β-Catenin(购自美国AffinityBiosciences,1∶500)、anti-Acetyl-β-Catenin(Lys49)(购自CellSignalingTechnology,1∶1000)、anti-GAPDH(购自美国Abcam,1∶10000)。TBST洗涤,室温孵育二抗(购自美国Abcam,1∶1000)。化学发光显色,记录分析结果。Anti-Acetyl-β-Catenin(Lys49)。

1.3阿尔新蓝染色

C3H10T1/2培养在24孔板中,分为3组:空白组(Control组)、Ad-GFP组、Ad-SIRT1组。感染腺病毒后2h更换培养基,此后隔日更换培养基,感染病毒后7、9d进行染色(染色剂购自Sigma-Aldrich公司)。样本细胞使用PBS平衡液清洗后,使用4%多聚甲醛固定,其余按操作流程进行,记录分析实验结果。

1.4碱性磷酸酶(ALP)染色

C3H10T1/2培养在24孔板中,分为3组:空白组(Control组)、Ad-GFP组、Ad-SIRT1组。感染腺病毒后2h更换培养基,此后隔日更换培养基,感染病毒后7、9d进行染色(染色剂购自Sigma-Aldrich公司)。样本细胞使用PBS平衡盐清洗后,按操作流程染色,记录分析实验结果。

1.5统计学分析

采用IBMSPSSStatistics19进行统计学分析,计量资料以x¯±s表示,多组间差异比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1腺病毒感染C3H10T1/2细胞

Ad-SIRT1、Ad-GFP感染C3H10T1/2细胞48h后观察到大约80%的细胞表达绿色荧光蛋白(图1A),证明腺病毒有效感染目的细胞。通过Westernblot检测SIRT1蛋白水平的表达情况,发现C3H10T1/2细胞感染Ad-SIRT1后,与Ad-GFP组比较SIRT1在蛋白水平获得明显高表达(图1B)。

2.2SIRT1促进了干细胞成软骨分化

Ad-SIRT1感染细胞后5、7、9d,通过Westernblot检测成软骨分化标志物表达情况,发现Ad-SIRT1组与Ad-GFP组比较Ⅱ型胶原(typeⅡcollagen,Col2A1)、蛋白多糖(Aggrecan)等成软骨分化标志物的表达明显增加(图2A～C,P<0.05);在第7、9天,通过AB染色发现SIRT1明显促进了软骨细胞外基质的分泌,Ad-SIRT1组染色与Control组、Ad-GFP组比较着色更深(图3)。结果证实在常规培养条件下SIRT1本身促进了干细胞成软骨分化的趋势。

图1Ad-SIRT1感染干细胞后证实SIRT1在蛋白水平上获得高表达

A:Ad-SIRT1、Ad-GFP感染干细胞后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达;B:Westernblot检测SIRT1蛋白水平表达

图2过表达SIRT1蛋白后成软骨、成骨分化标志物的表达

A:Westernblot检测成软骨、成骨分化标志物的表达水平1:Control组,2:Ad-GFP组,3:Ad-SIRT1组;B～E:成软骨分化标志物Col2A1、Aggrecan、Col1A1、OCN蛋白表达分析;a:P<0.05,与Ad-GFP组比较

图3过表达SIRT1后软骨细胞外基质表达及ALP的活性情况

2.3SIRT1促进了干细胞成骨分化

感染Ad-SIRT1后5、7、9d,通过Westernblot检测成骨分化标志物的表达情况,发现Ad-SIRT1组与Ad-GFP组比较Ⅰ型胶原(Col1A1)、骨钙素(osteocalcin,OCN)等成骨分化标志物的表达明显增加(图2A、D、E,P<0.05);在第7、9天,ALP染色实验发现Ad-SIRT1组有部分细胞着色,而Ad-GFP组与Control组无明显细胞着色(图3)。结果证实在常规培养条件下SIRT1基因本身同样也促进了干细胞成骨分化的趋势。

2.4SIRT1通过上调关键转录调控因子Sox9与Runx2蛋白水平促进干细胞的成软骨、成骨分化

通过Westernblot检测干细胞感染Ad-SIRT1后的第3、5天Sox9与Runx2蛋白表达水平。结果发现第3、5天,Ad-SIRT1组与Ad-GFP组比较Sox9蛋白水平明显增高(图4A、B,P<0.05)。Ad-SIRT1组与Ad-GFP组比较Runx2蛋白水平明显增高(图4A、C,P<0.05)。SIRT1提高干细胞成软骨、成骨分化关键转录调控因子Sox9与Runx2蛋白水平,这可能是SIRT1增强干细胞成软骨、成骨分化的机制。

图4过表达SIRT1后成软骨、成骨分化关键转录调控因子Sox9、Runx2的表达

A:Westernblot检测成软骨、成骨分化关键转录调控因子Sox9、Runx2的表达水平1:Control组,2:Ad-GFP组,3:Ad-SIRT1组;B、C:成软骨分化关键转录调控因子Sox9、Runx2蛋白表达;a:P<0.05,与Ad-GFP组比较

2.5SIRT1通过β-catenin信号调控干细胞的成软骨、成骨分化

进一步探讨β-catenin是否在普通培养条件下同样发挥了作用。在干细胞过表达SIRT1后,Ad-SIRT1组与Ad-GFP组β-catenin总蛋白水平无明显差异(P>0.05),但Ad-SIRT1组与Ad-GFP组比较β-catenin的乙酰化水平明显降低(图5A、B,P<0.05)。在使用特异性抑制XAV-939抑制β-catenin后,与Ad-SIRT1组比较,Ad-SIRT1+XAV-939组干细胞成软骨及成骨分化标志物表达明显降低(图5C～E,P<0.05)。因此,我们认为SIRT1通过β-catenin信号介导了干细胞的成软骨、成骨分化调控。

3、讨论

组织工程骨与软骨为临床上软骨、骨的缺损修复提供了新的选择。干细胞骨向分化相关生长因子,如骨形态发生蛋白(BMP)[12]、转化生长因子-β(TGF-β)[13]等已被深入研究。近来越来越多的研究提示一些年龄相关基因在调控干细胞分化中有着重要的作用。这些基因常常参与多种生命活动,包括细胞增殖与分化、抗凋亡、抗炎、抗衰老等。如果能够深入认识其在干细胞分化中的作用,并发挥其在组织工程中的功能,能在干细胞分化诱导、组织稳定性以及克服病损部位不良环境(如退变过程中的慢性炎症环境等)方面发挥重要作用。本研究主要讨论了普通培养条件下抗衰老基因SIRT1对干细胞成骨、成软骨分化倾向的影响。

SIRT1属于去乙酰化酶,与长寿有着非常密切的联系,参与多种生命过程的调控。近年来SIRT1在干细胞分化中的调控作用逐渐受到学界的关注。BUHRMANN[14]的研究认为SIRT1是干细胞成软骨分化的必须因子。ZAINABADI[10]也发现SIRT1能够正向调控Runx2进而调控干细胞成骨分化。然而这些都是在干细胞成软骨或成骨条件诱导培养下得到的研究结果,而SIRT1基因本身对干细胞分化方向的潜在影响并没有被深入的探讨。本研究则在普通培养基中进行研究,结果提示SIRT1不但能够促进干细胞的成软骨分化,还明显促进了干细胞的成骨分化。我们认为SIRT1可能是维持干细胞成软骨、成骨分化的重要基因,SIRT1在组织工程软骨、组织工程骨中有着较好的应用前景。有研究发现随着年龄的增加SIRT1表达的降低,使得干细胞成脂分化相对增强,成骨分化减弱,因此也有学者提出SIRT1也是骨质疏松治疗的潜在靶点[11]。

图5β鄄catenin信号对SIRT1介导的成软骨、成骨分化的影响

1:Control组，2:Ad鄄GFP组，3:Ad鄄SIRT1组，4:Control组，5:Ad鄄SIRT1组，6:Ad鄄SIRT1+XAV鄄939组；A:Westernblot检测β鄄catenin总蛋白与乙酰化水平；B:β鄄catenin总蛋白表达及乙酰化水平；C：抑制β鄄catenin信号后Western鄄blot检测成软骨、成骨分化标志物表达水平；D：成软骨分化标志物Col2A1及Sox9蛋白表达；E：成骨分化标志物Col1A1及Runx2蛋白表达；a:P<0.05，与AdGFP组比较；b:P<0.05，与AdSIRT1组比较

目前关于SIRT1干细胞分化的研究都是在诱导培养基培养下进行的,而我们的研究是基于普通培养条件进行的,主要探索SIRT1基于本身对干细胞分化的影响。有研究提示体外普通培养条件下过表达或者激活Sox9能够促进干细胞的成软骨分化[15,16,17,18,19],而过表达或者激活Runx2能够促进干细胞的成骨分化[18,19]。在本研究中我们的结果显示在干细胞内过表达SIRT1后,成软骨分化关键转录调控因子Sox9以及成骨转录调控因子Runx2蛋白水平均明显增加,这也应该是干细胞出现成软骨、成骨分化的直接原因。然而是何种原因导致其蛋白水平的增加目前机制不清,在接下来的研究中将进一步探索目的蛋白的乙酰化水平,揭示相关调控机制。从我们后续对β-catenin信号的抑制实验可以看出,抑制β-catenin信号后,Sox9、Runx2及其下游的分化标志物表达都明显降低。因此,我们认为β-catenin信号可能在其中有着非常重要的作用,与条件诱导培养下得到的结果类似[20]。在本研究中尽管普通培养基中没有添加任何诱导因子,但是不可否认的是普通培养基中加入的血清成分仍然可有少量生长因子的存在,进而在过表达SIRT1后促进了干细胞的分化。本实验中我们结果显示过表达SIRT1后,Ad-SIRT1组与Ad-GFP组比较C3H10T1/2存在明显的成软骨与成骨分化趋势,也足以证实SIRT1基因本身在促进干细胞成软骨、成骨分化中的作用。本研究未设置条件诱导培养下的阳性对照,是研究中的不足点。

综上,本研究证实在普通培养条件下抗衰老基因SIRT1能够促进干细胞向软骨细胞、骨细胞分化,进一步揭示SIRT1在骨与软骨再生领域的潜在应用前景。

参考文献：

[15]许运,陈亮,史勇,等.SOX9促进人脐带间充质干细胞聚集增强其向软骨分化的潜能[J].中华医学杂志,2012,92(29):2050-2054.

[19]杨光正,张文杰,丁迅,等.Runx2､Osterix转录因子过表达驱动内皮细胞成骨分化的机制探讨[J].上海口腔医学,2017,26(4):353-357.

周年,林鑫,陆杨.SIRT1通过β-catenin信号调控干细胞成软骨与成骨分化[J].第三军医大学学报,2020,42(13):1308-1314.

基金:重庆市自然科学基金面上项目(CSTC2019jcyj-msxmX0832);重庆医科大学附属第一医院院内培育基金项目(PYJJ2018-16).