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基于SHS结合GC-MS分析技术构建测定白酒酒醅中乙醇含量的内标法

2020-07-15 790 上传者：管理员

摘要：基于静态顶空（SHS）结合气相色谱质谱联用（GC-MS）分析技术建立内标法测定白酒酒醅中乙醇含量的方法。本方法采用顶空进样，内标法离子定量，结果表明，该方法在0.5%vol～3.0%vol之间具有良好的线性关系，回归系数R2=0.996，检出限为0.0027mL/100mL，样品加标回收率93.17%～100.05%。此法简单快捷，定量准确，适用于白酒酒醅中乙醇含量的测定。

关键词：
SHS
乙醇
内标法
分析化学
气相色谱-质谱
酒醅
静态顶空
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静态顶空技术（SHS）是色谱分析挥发性成分和半挥发性成分特有的进样方法[1]，其免除了繁杂的样品前处理过程，具有操作简单、花费少、易于自动化的优点，现已广泛运用于酿造、食品、医学检验等行业[1,2,3,4,5,6,7]。

白酒发酵是自然接种、多菌种参与、开放式、长周期的固态发酵。控制发酵的前置条件，如淀粉、水分、酸度、温度等，对维持发酵启动微生物菌群结构稳定、后续发酵过程微生物演替、代谢物质的形成、风味物质的转化至关重要。但一旦进入窖池进行酒精发酵，只能通过监控发酵过程中相关指标，来了解、掌握整个发酵的状态。酒醅中的乙醇含量作为众多监测指标之一[8]，其检测方法依然以传统蒸馏法为主[9]。近年来，气相色谱法、质谱法、顶空进样等以及结合其他检测方法的普遍使用，为酒醅中乙醇等挥发性成分的检测分析提供了简便、快捷、准确的新方法[9,10,11,12,13,14,15]，对指导白酒酿造生产具有很重要的意义。

本研究利用静态顶空进样技术结合气相色谱质谱联用（GC-MS）技术，建立一种内标法测定白酒酒醅中乙醇含量的方法，为白酒酿造过程中乙醇指标监控提供新的检测途径。

1、材料与方法

1.1材料、试剂及仪器

样品：白酒酒醅，由安徽宣酒集团股份有限公司提供。

试剂：无水乙醇（分析纯，99.7%），购自国药集团化学试剂有限公司；叔戊醇（≥99.5%），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他试剂为分析纯，均购自于国药集团化学试剂有限公司。

仪器设备：7697A型静态顶空进样器，美国Agilent公司；GC7890B-MS5977A型气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司；Aquapro2S超纯水机，美国艾科浦国际有限公司；ME204E/02电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1标准溶液配制

以无水乙醇为标准品与蒸煮后冷却的超纯水配制0.5%vol、1.0%vol、1.5%vol、2.0%vol、2.5%vol、3.0%vol的乙醇系列标准溶液；叔戊醇为内标，内标浓度为5mL/L。

1.2.2样品预处理

称取2g白酒酒醅样品于20mL顶空瓶中，加入10μL内标标准液和2mL经蒸煮后冷却的超纯水，漩涡振荡1min后置于静态顶空进样器中，待分析。

1.2.3仪器分析条件

顶空进样器条件：孵育温度45℃，孵育时间2min，顶空进样时间0.5min。

气相色谱分析条件：色谱柱：VF-WAXms(30m×250μm×0.25μm）；进样口温度：160℃；载气为He（≥99.999%），分流比为100∶1，流速为1.0mL/min；程序升温条件：40℃保持不变2min,20℃/min至160℃，保持5min。

质谱分析条件：EI离子源，电子能量为70.0eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃。离子监测（SIM）模式，目标物及内标物定性离子、定量离子、保留时间参考表1。

表1乙醇、叔戊醇的定量离子、定性离子

2、结果与分析

2.1样品预处理优化

酒醅中的乙醇能够在顶空瓶内部体系中得到充分的浸提，在固、液、气三相中达到平衡状态至关重要。实验将酒醅样品分别以直接挥发、蒸馏和浸提3种预处理方式进行分析实验，最终确定以浸提法作为该方法的预处理实验方案，即样品中加入一定量经蒸煮后冷却的超纯水，漩涡振荡后待测。根据1.2.3实验方法设定仪器分析条件，对样品进行GC-MS分析，见图1。

图1乙醇及内标物SIM模式分析色谱图

注：1—乙醇；2—叔戊醇

上述条件下，乙醇得到有效检出，且色谱峰分离效果好。考虑到固态样本不均一性，选择加一定量的超纯水，漩涡振荡，可使内标在平衡体系中与样品充分混合，优于直接挥发。蒸馏法相对操作复杂，分析效率较低，故未采用。

2.2分析方法的评价

根据1.2所示方法，配制乙醇标准溶液，以乙醇峰和内标峰峰面积的相对响应值为纵坐标，乙醇和内标物相对浓度为横坐标，建立内标法测定白酒酒醅中乙醇含量的标准曲线。结果显示，该方法在既定的浓度范围内具有良好的线性关系（R2>0.996），检出限（3S/N）为0.0027mL/100mL。相关参数见表2。

表2乙醇定量方法的线性和检测限

按照酒醅预处理方法，于酒醅中分别添加不同浓度水平（0.5%vol、1.5%vol、2.5%vol）的乙醇标准样品，进行加标回收实验。计算该方法的回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3。结果表明，该方法具有较高准确性和回收率，满足快速测定白酒酒醅中乙醇含量的要求。

表3乙醇定量方法的加标回收和相对标准偏差

2.3内标法和外标法连续多次进样结果分析

顶空进样是挥发性组分分析特有的进样方式，在外部平衡条件不改变的情况下，每一次进样，固定空间内的平衡体系中都伴随一定量目标物的损失；且体系将在每一次进样前重新形成新的平衡状态。本研究参考林琳等[9]开发的HS-GC-MS测定酒醅中乙醇含量的试验方法，进一步加以优化，采用稳定性更高的内标法，消除连续进样挥发系数不一致造成的结果不稳定现象；而且本方法采用SIM采集模式，更加精确，排除了出峰时间内其他物质的干扰。采用特征离子定量，分别对同一样品连续6次采样分析，比对内标法和外标法的稳定性，其结果如图2所示。

图2内标法与外标法连续进样结果比较

随着样品进样次数的增加，外标法定量结果呈逐渐减少趋势。内标法定量由于分别测定目标物与内标物特征离子的峰面积及相对校正因子，很好地解决了顶空重现性差的问题，内标物与乙醇在体系内形成比较稳定的平衡关系，其结果更加稳定准确，充分显示了内标法特征离子定量的优越性。

2.4SHS-GC-MS内标法与传统蒸馏法比较分析

实验采用上述SHS-GC-MS内标法与传统蒸馏法进行样品检测对比分析。据《白酒生产技术全书》中出池酒醅中乙醇含量测定方法：称取100g酒醅于500mL蒸馏烧瓶中，加水200mL进行蒸馏，得馏出液100mL，搅拌均匀，采用酒精计测定其酒精度，查表换算得出20℃时乙醇体积分数，单位为“%vol”。

由表4分析比较可得，SHS-GC-MS内标法与传统蒸馏法相比，其准确性和灵敏度更优。综合分析，传统蒸馏法易受温度、湿度等环境因素的影响，而SHS-GC-MS内标法前处理简单，干扰组分少，分析时间短，检测数值稳定、准确、可靠，满足白酒酒醅中乙醇含量的测定要求。

3、结论

采用SHS-GC-MS建立了内标法测定白酒酒醅中乙醇含量的方法，并对方法预处理进行选择、分析条件参数进行了优化，使得该方法具有很好的线性回归和回收率。与传统蒸馏法相比，本方法更为安全、快速、准确；与外标法相比，内标法由于其方法的优越性，可实现多次连续进样，重现性好，灵敏度高，数据更加稳定。综合分析，此法简便、快捷、精准，适用于白酒酒醅中乙醇含量的快速测定。

表4SHS-GC-MS内标法与蒸馏法的比较

参考文献:

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