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分化成巨核细胞的骨髓细胞在体外诱导方法研究

2020-08-15 261 上传者：管理员

摘要：目的：探讨体外将小鼠骨髓细胞诱导分化为巨核细胞的方案,用于中药活性评价。方法：从小鼠股骨和胫骨取骨髓细胞，在血小板生成素（TPO）及TPO和干细胞因子（SCF）或TPO、SCF、白介素-6(IL-6）和白介素-9(IL-9）联合诱导下，体外培养6d。然后用倒置显微镜观察培养体系中的细胞生长情况，自动细胞计数仪检测细胞数量，流式细胞术分析培养体系中巨核细胞比例，并计算巨核细胞绝对数量。结果：单因子或多因子联合诱导方法均能体外促进骨髓细胞分化成巨核细胞，TPO轻微促进骨髓细胞分化成巨核细胞，TPO和SCF联合及TPO、SCF、IL-6和IL-9联合均显著促进骨髓细胞增殖和分化成巨核细胞，添加IL-6和IL-9可促进骨髓细胞分化成巨核细胞，减少非巨核细胞增殖。结论：TPO、SCF、IL-6和IL-9联合具有最强的促进骨髓细胞分化为巨核细胞的作用，可以用于促血小板形成中药活性筛选和评价。

关键词：
促血小板生成素
巨核细胞
流式细胞术
诱导分化
骨髓细胞
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骨髓中造血干/祖细胞分化为巨核细胞（megakaryocytes）是生成血小板的关键过程，在多种细胞因子以及基质细胞等因素调控下完成定向的增殖和分化。通常认为，整个过程大致为造血干细胞增殖并分化为多能性祖细胞，再分化为共同髓系祖细胞。至此，细胞基本丧失向淋巴细胞分化的多能性，定向分化功能不断增强[1]。共同髓系祖细胞进一步分化为巨核-红系祖细胞，再分化为巨核祖细胞，然后分化为成熟的巨核细胞。巨核细胞通过边缘破裂脱落形成血小板[2,3,4]。血小板发挥粘附、聚集、促凝血等功能维持人体凝血稳态，是维持血液循环功能必不可少的血液成分。在放化疗、骨髓移植和血小板相关自身免疫性疾病等病理生理条件下，外周血血小板数量会显著降低并影响凝血功能[5,6]。

目前，临床常用的促血小板生成药物，主要有促血小板生成素（thrombopoietin,TPO）和小分子TPO受体激动剂[7,8,9]。这类药物虽然有较好疗效，但国外制药企业专利保护、昂贵的价格及生物制剂服用的不便，严重制约了血小板减少症的治疗。在传统中药中，鸡血藤、仙鹤草、虎杖和阿胶等具有促血小板升高的疗效，但是这些中药中促血小板升高的活性物质及其作用机制还缺乏系统研究[10,11]，严重制约了这些药物在血小板减少症中的应用。本研究将通过体外培养骨髓细胞，利用不同细胞因子组合诱导向巨核细胞分化，比较各种诱导方法对向巨核细胞分化的影响，以选择优化的骨髓细胞向巨核细胞分化方法用于中药及从中药提取分离化合物的促血小板作用筛选、活性评价和作用机制研究。

一、材料和方法

1. 试剂与仪器

IMDM细胞培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、青霉素和链霉素混合液均购自美国Corning公司；红细胞裂解液购自北京佰瑞达生物科技有限公司；FITC标记的大鼠抗小鼠CD117抗体、PE标记的大鼠抗小鼠CD41抗体、APC标记的大鼠抗小鼠Lineage抗体、3种抗体的同型对照抗体和7-氨基放线菌素D(7-AAD）死细胞染色液均购自美国BD公司；大鼠抗小鼠CD16/CD32抗体购自美国BioXCell公司；重组小鼠促血小板生成素（thrombopoietin,TPO）、干细胞因子（stemcellfactor,SCF）、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-9(interleukin-9,IL-9）均购自美国PeproTech公司；牛血清白蛋白购自美国Sigma-Aldrich公司。MCO-18AIC二氧化碳细胞培养箱购自日本三洋公司；DM500倒置荧光显微镜购自德国Leica公司；TC10自动细胞计数仪购自美国Bio-Rad公司；FACSCantoⅡ流式细胞仪购自美国BD公司。

2. 实验动物

雄性BALB/c小鼠（20g,6-8周龄），购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物质量合格证号：SCXK（京）2016-0002。北京中医药大学实验动物饲养设施合格证号：SYXK（京）2016-0038。小鼠在（22±2）℃和（55±10）%湿度的清洁级环境中自由饮水进食3d后用于实验。所有动物实验经北京中医药大学动物实验伦理委员会审批后进行。

骨髓细胞的制备和培养

颈脱臼处死BALB/c小鼠，75%乙醇水溶液浸泡小鼠全身5min后，超净台无菌取小鼠股骨和胫骨，利用1ml注射器吸取含2%胎牛血清的IMDM培养液将骨腔内骨髓细胞冲到15ml无菌离心管中，室温250×g离心5min，去上清；加5ml红细胞裂解液重悬细胞2min后，再加等量的含10%胎牛血清的IMDM培养液终止裂解，室温250×g离心5min，去上清；利用10%胎牛血清的IMDM培养液调整细胞浓度为1.25×106/ml，然后接种到24孔板，800μl细胞悬液/孔；除对照孔（不加任何细胞因子）外，设立3种不同刺激孔：单细胞因子TPO（终浓度50ng/ml）孔，双细胞因子TPO（终浓度50ng/ml）和SCF（终浓度50ng/ml）孔，以及TPO（终浓度50ng/ml）、SCF（终浓度50ng/ml）、IL-6（终浓度20ng/ml）和IL-9（终浓度20ng/ml)4种细胞因子联合作用孔，各种处理各设置3个复孔，各孔加入相应细胞因子至以上终浓度，培养液总体积1ml；将细胞置于37℃、5%CO2培养箱中培养6d,d3半量更新培养液，并重新添加1次细胞因子。

细胞生长的倒置显微镜观察

取上述6d的细胞在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况，并进行拍照。

活细胞自动计数

将各孔细胞收集至2ml离心管中，取100μl细胞悬液与等体积台盼蓝染色液混合，室温染色10min，取20μl染色细胞到自动细胞计数板上，进行自动细胞计数。

巨核细胞的流式细胞术分析

将自动细胞计数剩余的细胞4℃、350×g离心5min后弃上清，并利用200μl流式染色缓冲液（含0.2%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，pH7.2）重悬；取部分细胞设置空白染色样本、同型对照样本和每种荧光抗体的单标样本；除空白染色样本之外，在各样本细胞悬液中加入大鼠抗小鼠CD16/CD32抗体（5μg/ml），冰浴30min封闭FcγRⅢ/Ⅱ；再在个样本中加入相应混合抗体、单标抗体或同型对照抗体，冰浴30min；加入1ml流式染色缓冲液洗涤细胞，4℃、350×g离心5min后弃上清，并重复2次；最后加入0.5ml流式染色缓冲液重悬细胞，尼龙膜过滤后进行上机检测。设置上述染色方案的前向和侧向散射光电压值以及各种荧光染色的电压值，并调试好各荧光通道之间的荧光补偿；收集各样本细胞的前侧向散射光及各种荧光染色信号；在测定过程中，通过调整前侧向散射光设置P1门，以去除细胞碎片，收集3万个P1门细胞的检测信息。

3. 统计学分析

利用Flowjo7分析流式细胞术检测数据，分析各种细胞样本中巨核细胞在7-AAD-Lin-细胞中的比例，并根据活细胞总数计算总巨核细胞数量。采用GraphpadPrism5.0软件进行统计分析，采用student′st检验比较两组数据间差异，所有实验重复3次以上，定量实验数据以平均数±标准差（±SD）表示，P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1. 细胞生长

倒置显微镜下观察显示，经过6d的体外培养，对照孔细胞大部分已经死亡碎裂，只剩余少量贴壁的梭形纤维细胞和圆形的非贴壁细胞。TPO处理孔中存活的圆形非贴壁细胞有所增加；TPO和SCF联合处理孔细胞增殖最为明显，细胞呈小圆形聚集生长状态；TPO、SCF、IL-6和IL-9等4种因子联合处理孔也出现较为明显的细胞增殖，其中圆形非贴壁细胞体积较大，呈分散生长状态（图1）。

2. 活细胞计数

根据自动细胞计数仪计数结果，整体来看，不添加细胞因子时体外培养骨髓细胞逐渐死亡，接种的1百万个细胞经过6d的体外培养，只剩余约3万个活细胞；TPO处理后细胞数量有所上升（P<0.05），但仅增加不到1倍的数量；TPO和SCF联合处理后，细胞数量显著增加（P<0.05）,并增加达10倍以上；4种细胞因子联合处理后，细胞数量也呈显著增加状态（P<0.05），增加约7倍左右，但相对TPO和SCF联合处理，细胞增加更少一些（P<0.05）（表1）。

3. 巨核细胞的分析

各种诱导条件处理的细胞经流式细胞术分析发现，不经细胞因子处理及TPO单独处理细胞样本中，FSC和SSC显示主要为细胞碎片；TPO和SCF联合处理细胞样本及4种因子联合处理细胞样本中，FSC和SSC显示具有明显的存活细胞群体，存活细胞数量及其FSC和SSC特征有所不同（图2A）。通过设门分析7-AAD-Lin-细胞中CD117和CD41的表达发现，7-AAD-Lin-CD117-CD41+巨核细胞在7-AAD-Lin-细胞中比例差异较大，TPO处理孔细胞中巨核细胞比例高于对照孔，TPO和SCF联合处理孔及4种因子联合处理孔中巨核细胞比例高于TPO单独处理孔，4种因子联合处理孔中巨核细胞比例又高于TPO和SCF联合处理孔（图2B）。

利用各种诱导条件的处理孔及对照孔中活细胞总数和Lin-细胞比例，计算各孔中巨核细胞总数，并利用GraphPadPrism5.0对巨核细胞比例和总数进行统计分析。结果显示，3种诱导条件均导致巨核细胞比例及其总数显著上升（P<0.05),TPO和SCF联合处理孔及4种因子联合处理孔中巨核细胞比例和总数都显著高于TPO单独处理孔（P<0.05),4种因子联合处理孔中巨核细胞比例和总数显著高于TPO和SCF联合处理孔（P<0.05）(图3A、B)。

三、讨论

巨核细胞可以由巨核祖细胞、红系-巨核系祖细胞、共同髓系祖细胞、造血干祖细胞分化而来。为了获得尽量多的巨核细胞和提供药物评价的可操作性，本研究直接利用骨髓细胞来诱导分化成巨核细胞。在文献报道中，巨核细胞可以由TPO以及TPO联合SCF、IL-6、IL-9、白介素-3(interleukin-3,IL-3）和白介素-11(interleukin-11,IL-11）等细胞因子来诱导分化[12,13,14]。TPO可以作用于早期造血干细胞，促进造血干细胞增殖，同时也是促进红系-巨核系祖细胞和巨核祖细胞分化为巨核细胞的必需因子。SCF是CD117的配体，对CD117+的造血干祖细胞均有刺激作用，可以促进造血干祖细胞增殖。IL-6、IL-9、IL-3和IL-11等细胞因子对造血干祖细胞的调节作用复杂，对巨核细胞生成都具有一定的促进作用[13,14,15,16,17]。本研究利用TPO单独诱导巨核细胞生成，以观察其诱导巨核细胞生成的能力；利用TPO和SCF联合诱导巨核细胞生成，以在促进造血干祖细胞增殖的情况下，尽可能多的获得巨核细胞；最后继续添加IL-6和IL-9这2种诱导分化体系中经常加入的细胞因子，观察其对巨核细胞分化的影响。

研究结果显示，相对于对照，TPO单独诱导只能轻微增加巨核细胞生成，巨核细胞总数仅仅增加了1倍。这表明，TPO单独诱导对巨核细胞的生成促进作用极为有限，这可能是因为TPO在没有其它细胞因子存在的条件下，只能作用于巨核祖细胞促进其分化为巨核细胞。TPO和SCF联合诱导不仅显著增加巨核细胞生成，提升巨核细胞的比例，同时也极大地促进了骨髓细胞增殖，使获得的巨核细胞总数显著增加。在TPO和SCF存在条件下，进一步添加IL-6和IL-9，使巨核细胞比例进一步提高，但是抑制了骨髓细胞增殖，不过巨核细胞总数相对于TPO和SCF的联合诱导有显著提高。这表明，添加IL-6和IL-9可以抑制骨髓造血干祖细胞向非巨核细胞方向增殖和分化，能够进一步促进巨核细胞生成和提高获得的巨核细胞数量及其纯度。

在中药提取物及从中分离化合物的体外促血小板生成活性评价中，促进向巨核细胞分化是1项重要的评价指标。由于向巨核细胞分化需要多种因子共同作用，如果仅仅加入中药提取物和化合物，巨核细胞很难增殖，从而也难以评价中药提取物和化合物的活性。如果仅加入TPO诱导向巨核细胞分化，由于其作用太弱，也很难评价中药提取物和化合物的活性。本研究结果提示，TPO和SCF联合诱导或TPO、SCF、IL-6和IL-9联合诱导均能促进骨髓细胞分化成巨核细胞，可以用来评价中药提取物和化合物的促进向巨核细胞分化的作用。特别是TPO、SCF、IL-6和IL-9联合诱导，只要中药提取物和化合物能够激活这4种因子下游信号通路，就应该会进一步促进巨核细胞和血小板形成。因此，本研究将利用TPO、SCF、IL-6和IL-9联合诱导生成巨核细胞用于后续的中药提取物和化合物的促血小板形成活性的筛选、药效评价和机制研究。

参考文献：

[10]张蓓,胡丕丽,丘惠娟,等.升板方治疗化疗后血小板减少的疗效观察.癌症,2004;23(11):1470-1472.

[11]冯云云,王新华,岳伟.中西医结合治疗小儿特发性血小板减少性紫癜疗效观察.四川中医,2005;23(8):91-92.

李芸芊,郭冉,屠鹏飞,朱枝祥.体外诱导骨髓细胞分化成巨核细胞的方法学研究[J].中国实验血液学杂志,2020,28(04):1357-1362.