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制备人间充质干细胞来源的细胞外微囊的适宜条件研究

2020-08-15 205 上传者：管理员

摘要：目的：探讨制备人间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）来源的细胞外微囊（extracellularmicrovesicle,MV）的适宜条件。方法：无血清条件下培养人脐带来源MSC，细胞融合达80%时,用基础培养液培养72h后，收集培养细胞的上清，使用浓缩试剂浓缩细胞外微囊，经流式细胞术及电子显微镜鉴定，以蛋白总量为微囊含量指标。调整上清不同pH值，探测MV收获量。去营养后，收集不同培养时间的培养上清，富集微囊并测定蛋白含量，确定不同培养时间微囊产量。结果：富集的细胞外微囊表达CD9、CD63和CD81，电子显微镜下微囊呈圆形，直径在100nm左右。使用微囊富集试剂盒收集、培养上清pH值分别为3,7和9时，每107个MSC收获的蛋白量分别为416.8±128.1、255.4±77.9和142.8±46.4μg,3组比较有明显差异（P<0.05）。饥饿培养48、72和96h，每107个MSC收获的蛋白量分别为173.6±44.5、262.4±49.6和364.2±37.8μg,3组存在显著差异（P<0.05）。结论：去营养培养96h后收集MSC培养上清，调整pH值至3.0，可获得较多的细胞微囊。

关键词：
培养细胞
无血清培养
细胞外微囊
细胞学
间充质干细胞
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间充质干细胞（mesenchymalstemcell,MSC）是一群可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞的成体干细胞，MSC体外扩增能力强，其分泌的细胞因子具有免疫调节、促血管新生以及趋化作用[1,2]。也正是如此，MSC已进入临床试验研究，用于移植物抗宿主病、克隆氏病、骨关节炎等疾病的治疗[3]。但是，关于MSC治疗的确切机制，至今仍未有定论[4]。

一般认为，体外培养的MSC进入体内后，大多数细胞在短期内死亡，MSC治疗的主要机制在于其旁分泌作用[5]。MSC旁分泌的形式主要有二种：(1)生物大分子或活性物质的分泌，如细胞因子、细胞生长因子等；(2)分泌的物质具有浆膜包裹的结构，即外泌体及微囊，统称为细胞外微囊（extracellularmicrovesicle,MV)[4,5]。MV参与细胞间通讯及细胞信号传递过程，可以长距离改变细胞或组织的代谢，从而影响组织对损伤的反应[4]。MSC来源的MV(MSC-MV）含有多种细胞因子和生长因子，以及具有调节功能的脂类物质及微小RNA[6,7]。基于这些物质，MSC-MV具有免疫调节、促血管新生及促进组织修复等多种功能，因此，MSC-MV可能成为临床实施无细胞-细胞治疗的新方式[4,5,6]。

然而，MSC-MV的分离方法及相关程序，至今仍有待改善。譬如，低氧无血清处理的具体步骤，细胞因子刺激对MSC分泌MV量的影响，不同方法收获MV过程中的收获率等，都需要进一步研究阐明。本研究以脐带间充质干细胞（umbilicalcord-derivedMSC,UC-MSC）为研究对象，探讨低营养刺激时间及培养上清pH值对MSC-MV收获量的影响。

一、材料和方法

1. 试剂与仪器

人MSC无血清培养液、胰酶、细胞外微囊分离试剂（中国科霖恩生物科技有限公司），FITC标记的抗人CD9、CD63和CD81抗体（中国Biolegend公司），直径3.9μm的表面乙醛化乳胶珠（美国Invitrogen公司），BCA蛋白定量检测试剂盒(美国Sigma公司)，CytoFLEX流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)，CO2细胞培养箱（美国ThermoFisherScientific公司），高速离心机（德国eppendorf公司），倒置显微镜（日本Olympus公司）。

2. 细胞培养

按照试剂盒说明书操作，分离培养人UC-MSC，所获得MSC符合相关标准[8]。选择第3代细胞用于以下实验。将UC-MSC按照接种密度为2×10[6]细胞/皿接种培养于直径为150mm的培养皿中，培养液体积为20ml。细胞密度达到80%左右时，吸去培养上清，加入10ml生理盐水洗涤。重复洗涤2次后，加入基础培养液（不含白蛋白、胰岛素、转铁蛋白等成分）20ml/皿。收集培养不同时间的上清，用于MSC-MV的浓缩。

3. MSC-MV的收集

按照细胞外微囊分离试剂盒说明进行操作。收集细胞培养上清，室温条件下2000×g离心10min，去除细胞碎片。将培养上清分别经过孔径为1、0.45和0.22μm的滤膜过滤。取50ml离心管，加入细胞外微囊分离试剂10ml。加入经过处理的细胞培养上清40ml，充分混匀，置于4℃过夜，然后2000×g离心30min，移除液体，2000×g再次离心5min。加入PBS500μl溶解沉淀，备用。

4. 蛋白浓度测定

按照试剂说明进行操作。以牛血清白蛋白为标准品，测定OD560，制定标准曲线，并计算蛋白浓度。

MSC-MV细胞表面分子标记物的流式细胞术检测

按照文献报道的方法进行9。将乳胶珠加入含MSC-MV的MES缓冲液中，4℃结合过夜。离心后用甘氨酸封闭，加入抗体反应30min。洗涤后，流式细胞仪收集数据，Flowjo6.0软件分析结果。

电子显微镜观察MSC-MV

将MSC-MV固定至铜网上，透射电子显微镜观察并照相。

二、统计学分析

应用SPSS20.0进行统计学处理。本研究计数资料采用均数±标准差表示，各组间差异采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

流式细胞术分析结果显示，MSC-MV表达CD9、CD63和CD81，比例均在50%以上，提示所获得MSC-MV大部分为外泌体（图1）。透射电子显微镜观察发现，MSC-MV呈圆形，中空，直径在100nm左右，符合MV特征（图2）。

上清pH值对收获MSC-MV量的影响

为探讨上清不同pH值对MSC-MV收获量的影响，将MSC饥饿培养72h后，收集上清，离心去除细胞碎片，过滤去除凋亡小体等；使用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液，调整上清pH值分别至3、7和9；然后，按照前述方法收获MSC-MV。蛋白定量作为MV含量指标。5次重复结果显示，培养上清pH值分别为3、7和9时，每10[7]MSC收获的蛋白量分别为416.8±128.1、255.4±77.9和142.8±46.4μg，随着上清pH值增加，MSC-MV收获量不断减少，3组比较有明显差异（P<0.05）。这些结果提示，低pH值可促进MSC-MV的沉降，增加MV收获量（图3）。

饥饿时间对MSC-MV收获量的影响

将MSC饥饿不同时间发现，96h大部分细胞仍处于贴壁状态；之后，延长培养时间，细胞有大片脱落现象。因此，将饥饿时间定为最长96h。不同时间收集培养上清，调整pH值至3，利用MSC细胞外微囊分离试剂沉降MSC-MV。5次重复实验结果显示，饥饿培养48、72和96h，每10[7]MSC收获的蛋白量分别为173.6±44.5、262.4±49.6和364.2±37.8μg，随着饥饿时间增加，MSC-MV收获量不断增加，3组存在差异（P<0.05）。这些结果表明，将MSC饥饿96h，可能是收获MSC-MV的较佳时间（图4）。

三、讨论

细胞之间的通讯，既依赖于细胞之间的直接接触，也依赖于可溶性因子及细胞分泌的MV。体外培养的MSC，无论通过何种途径，如静脉注射、肌肉注射或损失局部注射，进入体内后均在短期内死亡。MSC死亡前所释放的MV，可能是MSC-MV主要的作用方式[5,6]。因此，使用简便的方法规模化制备MSC-MV是实现无细胞-细胞治疗的基础。

目前，MV的分离方法主要有超高速离心、极性沉降、免疫吸附、柱层析等[10]。超高速离心所需设备昂贵，而且，每次处理标本量较少，不适于规模化制备MV。柱层析法可大量制备MV，但是，MV回收率较低。免疫吸附结合柱层析法需要设备多，每次处理样品量少。极性沉降法实验方法简单，但是，外泌体纯度低。本研究以探索MV制备条件为目的，利用基于极性沉降原理设计的细胞外微囊分离试剂，分离收获MSC-MV。流式细胞术分析结果发现，所获得的MSC-MV中，表达外泌体特异标记分子（CD9,CD63和CD81）比例在50%以上，但不足70%，提示相当部分MV为膜微囊，外泌体比例在50%-70%之间。这与使用的试剂盒原理有关，也与预期结果一致。

无血清或无血清加低氧条件是刺激MSC分泌MV的常用处理方法。在无血清及2%氧条件下培养人骨髓MSC72h,MV释放量是常氧培养条件下的2倍以上[11]。在本研究中，人脐带MSC在无血清饥饿条件下，MV释放量随着时间的延长而增加。然而，细胞在该条件下培养超过96h，多数细胞脱壁死亡，而细胞死亡释放的基因组DNA，会影响后续的MV分离实验。这提示，无血清饥饿培养96h，可能是收获培养上清进而分离MV的较适宜时间。

既往的研究提示，向标本中加入醋酸钠可提高MV收获量，这可能与增加溶液中离子浓度，利于MV沉降有关[12]。本研究结果显示，低pH值也利于MV的沉降，pH值为3时，MSC-MV收获量是溶液碱性（pH=9）时的2倍左右。在降低溶液pH值的同时，加入高浓度盐溶液是否使MV提取量进一步提高，需得到更多的实验证实。然而，过高的离子浓度可能会促进脂蛋白等大分子物质的沉降，从而影响所获得MV的纯度。基于以上实验，将人脐带MSC无血清培养96h后收获培养上清，之后将pH值降低，利用基于极性沉降原理设计的细胞外微囊分离试剂，可获得较多的MSCMV。该实验方法操作简单，值得推广应用。

参考文献：

[2]王利,马得勋,刘书锋,等.间充质干细胞防治移植物抗宿主病的研究进展.中国实验血液学杂志,2019,27(1):283-287.

[3]张薇薇,郭子宽.间充质干细胞临床试验中的问题及其解决策略.中国实验血液学杂志,2007;15(4):901-904.

[5]李志勇,郭子宽,郭志坤.释放膜微粒:间充质干细胞治疗的新机制.组织工程与重建外科杂志,2012;8(3):164-166.

[7]王晓庆,朱晓健,邹萍.间充质干细胞来源微泡的研究进展.中国实验血液学杂志,2013,21(1):227-230.

[11]毕晓云,黄舒,陈晶砺等.人骨髓间充质干细胞释放膜微囊条件探索.中国实验血液学杂志,2014;22(2):491-495.

吴波,毕晓云,卢怀笋,朱海勇,马正东,唐海.制备人间充质干细胞源细胞外微囊条件探索[J].中国实验血液学杂志,2020,28(04):1363-1366.