体色在动物求偶、逃避敌害及信号交流等方面起着重要作用,是脊椎动物多样性最丰富的形态之一。体色是鱼比较独特的性状,其体色调控与自身和人为选择有关[1]。鱼类繁殖期较短而且受外部影响较小,体色多种多样,是研究色素细胞的一种优良材料。通过人为调控,可以在鱼类体色筛选上发挥引导作用。对鱼类体色形成机制的研究,为研究包括人及其他生物色素细胞的生理、病理、遗传等提供重要的理论借鉴。通过分析鱼类体色相关基因研究状况,为后续相关深入研究提供理论基础。

1、色素的形成

1.1 色素细胞

能够在特定的细胞器内,完成产生有色色素这一独特过程的细胞被定义为色素细胞[2]。鱼类色素细胞源于神经嵴细胞[3],神经嵴是在神经板和非神经外胚层边界形成的迁移性多能细胞群,并产生多种细胞类型,包括色素细胞[4]。哺乳动物和鸟类有单一类型的色素细胞,即黑色或棕色黑色素细胞。目前鱼类色素细胞基本包括黑色素细胞、红色素细胞、虹彩细胞、黄色素细胞、白色素细胞以及在鳜鱼中发现的蓝色素细胞等共6种[6]不同色素细胞,它们在色素颗粒、形态结构等方面均存在差异,其中黑色素细胞是一种广泛存在于各种动物体的真皮和表皮中的色素细胞,是目前色素细胞研究的主要载体。

1.2 黑色素

黑色素的生物合成涉及细胞内多种酶,如多巴氧化酶(Dopaoxidase)、酪氨酸羟化酶(Tyrosinehydroxylase)、5,6-二羟基吲哚(5,6-dihydroxyindole,DHI)氧化酶等的催化作用及多种生理刺激物如促黑素细胞激素(melanocyte-stimulatinghormone,MSH)、内皮素(Endothelin,ET)、紫外线等的影响[7]。黑色素细胞内的黑色素颗粒是显色的重要物质,通过对特定波长光的吸收而呈现黑色。黑色素细胞在体内的密集程度会影响鱼体色深浅,当黑色素在体内扩散时体色加深,聚集时致使体色变浅[8]。鱼类体内适当的黑色素不仅可以保护皮肤免受辐射,还可以抵抗环境污染等因素带来的危害,但是体内过多或过少的黑色素会导致一些疾病如霉病等。

鱼的体色是由体表的皮肤内所含的色素细胞的种类、数目及分布决定的[9],黑色素细胞在鱼类体色形成过程中起主导,合成过程中受许多相关基因的调控。黑色素细胞能产生两种不同类型的黑色素:真黑素和褐黑素[10]。其形成主要依赖于酪氨酸酶基因家族中酪氨酸酶(Tyrosinase,TYR)[11]。

黑色素在细胞内的合成大致可分为2个阶段:第1阶段是由酪氨酸酶催化,由酪氨酸被氧化生成多巴,并进一步生成多巴醌;第2阶段分为真黑素和褪黑素的合成过程。真黑素的合成是由多巴醌经过一系列化学反应生成不稳定多巴色素,后经多巴醌氧化为稳定的多巴色素,经过异构化和脱羧作用,生成5,6-二羟基吲哚(DHI),最后由酪氨酸酶催化氧化DHI生成真黑色素前体吲哚-5.6-醌。褪黑素的形成则是由多巴醌与半胱氨酸反应生成5-Cys-多巴和5-Cys-多巴醌,经过脱羧等最终生成褪黑素[12]。

2、影响黑色素合成的基因

2.1 TYRP1基因

酪氨酸酶相关蛋白1基因(tyrosinase-relatedprotein1,TYRP1),与黑色素的形成有关,定位于小鼠4号染色体上的Brown位点。人的TYRP1全长37kb,编码区序列长1.6kb,可翻译出537个氨基酸(包含一个信号肽)[13]。TYRP1编码DHICA(二羟基吲哚羧酸)氧化酶的蛋白,DHICA氧化酶作为黑色素生物合成的三酶中的一员,在黑色素细胞中由酪氨酸合成黑色素的下游途径中起重要作用,同时参与黑色素的代谢,影响黑色素细胞的生长进程[14],DHICA是黑色素合成的中间体,其生成速率会影响黑色素的大小、种类及结构。通过构建TYRP1编码基因的cDNA的反义真核表达载体及稳定表达小干扰RNA(SmallinterferenceRNA,siRNA)的载体,反义转染黑色素细胞和黑色素瘤细胞,发现两种细胞内的酪氨酸酶(tyrosinase)活性明显降低,说明在黑素瘤细胞中阻断TYRP1基因及蛋白水平的表达会影响细胞的增殖[15]。TYRP1突变会影响细胞器(黑色素体)内酪氨酸酶的活性,同时参与黑色素小体(合成黑色素的特定场所)的成熟和黑色素细胞的增殖、分化与凋亡[16]。通过基因敲除实验,进一步证实了在缺乏TYRP1的脊椎动物中,棕色黑素体受真黑素合成改变的影响,黑色真黑色素的形成主要依赖于TYRP1的存在[17]。张学堂等通过实验发现,TYRP1在白化病黄颡鱼鳍中表达水平最高,TYR和TYRP1mRNA在正常组中检测到较高的表达水平,TYRP1可能在色素沉着中起重要作用[18]。TYR和TYRP1的突变会延长二者与钙连蛋白和结合蛋白的结合,这两个基因中的一个突变,选择性地提高伴侣蛋白相互作用的持续时间和效率,并显著减慢了它们向黑素体的转运,表明了黑色素生成中蛋白的突变会影响另一种黑色素生成途径的成熟和稳定性[19]。

目前发现,在鱼类和其他脊椎动物中,TYR的相关蛋白的突变和缺失导致皮肤着色的异常。TYRP1基因通过调控基因的表达、蛋白质结构以及体内表达产物间相互作用等调控色素的生成。TYRP1在稳定酪氨酸酶活性、间接地控制黑素的生成、影响黑素细胞正常的增殖与凋亡、形态和功能等方面都拥有难以取代的重要作用。关于TYRP1的研究,不仅可以了解某些鱼类白化病发生的分子机制,还有利于构建基于TYRP1转基因相应疾病的模型[20]。

2.2 SOX10基因

性别决定区基因(SexdeterminingregionY-box10,SOX10),编码SOX家族的转录因子,参与了早期的神经嵴细胞发育和分化[21]。对SOX家族基因研究发现,其在众多生命活动所必需的发育过程中都有参与,例如软骨的形成及发育、神经嵴及神经系统的发育、晶状体的发育、性别的决定与发育、血细胞生成等过程发挥不可或缺的生物学功能[22,23,24]。斑马鱼的发育过程中,SOX10在迁移前和迁移的细胞中均特异性表达,有利于色素细胞形成大部分沿腹背轴的浅色条纹[25]。SOX基因43位上编码精氨酸的密码子产生无义突变,可能是引起该综合征II型的分子生物学致病原因[26]。SOX10编码的蛋白是黑色素细胞的分化和行使功能的重要转录因子,SOX10与多巴色素异构酶(DCT)基因在早期黑素细胞中共存,并且SOX10可体外激活DCT启动子[27,28]。

但目前对于SOX10基因在鱼类中的报道较为少见。除白色素细胞外,所有色素细胞的发育都依赖于SOX10,SOX5对斑马鱼色素细胞中的SOX10活性进行拮抗性调节[29,30,31]。通过采用荧光定量PCR技术对SOX10基因在瓯江彩鲤中的表达量进行多方面的综合分析,发现“粉玉”白表皮中的皮肤中表达量最高[32]。瓯江彩鲤的体色受SOX10基因表达量的高低影响,同时受其他基因的共同调节。

SOX10基因与其他相关基因共同调控黑色素细胞形成的过程。目前,SOX10染色是目前常用检测疾病的方式,研究SOX10基因对体色的调控机制,可以给黑色素瘤治疗方面寻找到新的方向。

2.3 DCT基因

多巴色素异构酶基因(dopachrometautomerase,DCT)又称为酪氨酸酶相关蛋白2基因(tyrosinaserelatedprotein2,TYRP2),与酪氨酸酶(TYR)和酪氨酸蛋白酶1(TYRP1)共同作为酪氨酸酶相关蛋白家族的成员,都是具有独特功能的黑色素生成酶[32,33],具有多巴色素异构酶活性。DCT基因位于第13号染色体上,其蛋白是参与黑色素生成的酵素之一,并负责将多巴色素羟化为DHICA,而后再进一步合成为真黑色素,最终加速黑色素的形成[32],而不同比例的真黑色素和黑色素对皮肤或者表皮颜色的变化有着重要的影响[34],故DCT是影响体色的重要蛋白基因。Agnès[35]等通过在河豚中发现了3个酪氨酸酶家族成员的存在,并强调了色素系统在长期进化过程中受到了3个酪氨酸家族的保护。

DCT、TYR和TYRP1共同作用于黑色素细胞,调节黑素的种类和数目,促进黑色素细胞的发育和成熟[36],共同影响着体色基因的表达。而TYR或TYRP1的突变会影响彼此的加工、稳定和功能,但都不会影DCT[37]。DHICA作为一种有活性的真黑素前体,具有强效抗氧化的作用。在没有DCT的参与的情况下,多巴色素会自动脱羧转化为DCT,从而降低DHICA在细胞中的含量。DHI是一种比DHICA毒性更强的中间体,其浓度过高时可降低体内的黑色素细胞数量[38],因此黑素细胞中的DCT基因调控细胞内DHICA/DHI的比例,即DCT基因可以通过限制中间产物—脱羧基吲哚,进而减少DHI对黑素细胞的毒性,在鱼类体色以及视网膜颜色表达中起重要作用[39]。

在对不同脊椎动物的氨基酸相似度的比较后发现,脊椎动物中的DCT基因是高度保守的基因[33]。通过对红鳍笛鲷黑色和红色表皮研究发现,DCT基因在鱼类的眼睛、黑色和红色体色皮肤中的表达量逐渐减少[40]。

2.4 MC1R基因

黑素皮质素受体1(melanocortin1receptor,MC1R)基因,也称促黑素细胞激素受体基因[41],在脊椎动物中编码G蛋白基因家族的跨膜受体成员。该基因通过G蛋白依赖的cAMP信号传导途径的激活,介导黑素皮质素[42]。MC1R基因编码区最近在硬骨鱼类中被发现,与其他脊椎动物类似,它由一个单拷贝、单外显子基因组成,其中包含7个保守的跨膜区域[43]。MC1R基因主要在动物的毛囊和皮肤组织中表达,与皮肤黑色素沉积具有密切的联系。鱼类体表的褪黑程度,与其自身MC1R基因的表达量呈现负相关[44]。

鱼类除了遗传上体色的改变,还表现出对环境变化的快速生理变化,这种生理变化并不依赖于突变,而是依赖于调节皮肤不同区域的局部黑色素和黑色素团浓度以及其他色素体浓度。这种反应也依赖于MC1R对cAMP信号通路的诱导,因此在其序列和调节中受到遗传变异的影响[42]。Jun等[45]通过对孔雀鱼两个不同长度的等位基因进行鉴定,发现不同MC1R基因型黑色素沉着情况不同,表明MC1R基因型与黑色色素沉着之间存在关联,但还受其他基因的影响。

2.5 Agouti基因

鼠灰色基因Agouti,其信号蛋白(ASP)由真皮乳头细胞分泌,可拮抗α-黑色素细胞刺激激素(α-MSH)与其受体MC1R的结合,从而不仅抑制黑色素的产生[46],也可控制黑色/棕色色素(eumelanin)与黄色/红色色素(pheomelanin)间的转换,从而改变色素细胞分化平衡[47]。Agouti信号蛋白可通过激活酪氨酸酶来调节真黑色素与褐黑色素的生成,从而直接影响鱼类皮肤颜色。若Agouti信号蛋白表达量较低,则黑色素/褐黑素的比例高,鱼类偏向黑色,反之偏向浅黄色[48]。在哺乳动物和鱼类中,Agouti信号蛋白开辟了一个不同的细胞机制[47]。它可以控制鱼类进化的着色,开拓了多种色素细胞类型分化的独特细胞机制[47]。目前,Agouti基因在哺乳动物的研究中较为广泛,但在鱼类中的研究较少。李康乐[32]克隆了瓯江彩鲤Agouti基因的cDNA全序列,通过组织分布的半定量RT-PCR检测,探讨了该基因在不同类型表皮中的表达差异。该研究表明,Agouti基因在瓯江彩鲤的多个部位中(除皮肤外)均有表达,其中在皮肤和肾中的表达量最多。通过对不同发育时期的锦鲤的研究发现,Agouti基因表达量在其原肠胚和神经胚期出现峰值,随后降低[49]。

3、总结与展望

早在1954年,已有研究人员通过对成体鱼类的皮肤的研究,发现黑色素细胞并猜想在鱼体内可能存有黑色素干细胞。半个世纪后,Johnson通过对斑马鱼的研究证实了前述的猜想。尽管目前对该领域的黑色素细胞与黄色素细胞的方面研究较多,但对于其各基因之间的相互影响以及其他色素细胞的研究仍有缺乏,还需从不同方向进行着手研究。未来在培育新的稀有观赏鱼类、改变渔业的模式化等方面都具有极大的发展空间。此外,由于鱼类的体色受到多种因素的影响,不单由基因决定,更是受到环境的影响。因而今后研究可能需要将外界因素与内部的调控机制的联合讨论,例如在鱼饵料中是否有某一种物质使得鱼类体色趋于某一种颜色。另外,受体的识别信号以及传递机制也尚未明确。近年来关于体色形成机制的实验多采用实时荧光定量、基因敲除、克隆、测序及单核苷酸位点突变等方法,对体色相关基因与色素形成进行相关研究,为更深入认识鱼类体色形成机理、揭示相关色素疾病形成以及观赏鱼类的培育等提供了技术支持,但仍需要需进一步的研究。

参考文献：

[1]粟敏,肖亚梅,莫艳秀.鱼类色素细胞的研究进展[J].中国科技纵横,2015(8):228–229.

[7]李韶勇,孙命,曲娜,等.黑色素的合成及其常见抑制剂的作用机理[J].天津师范大学学报(自然科学版),2002,22(1):17–21.

[9]刘晓东,陈再忠.鱼类色素细胞及体色调控[J].水产科技情报,2008,35(1):13–18.

[10]史东杰,梁拥军,孙砚胜,等.锦鲤“御三家”新品系的选育[J].水产科技情报,2014,41(3):152–154.

[11]赵美娟,户晶晶,倪辉,等.黑色素生成信号通路研究进展[J].生物工程学报,2019,35(9):1633–1642.

[12]庄江兴.α-synuclein蛋白及抑制剂对酪氨酸酶的调控机制[D].厦门:厦门大学,2009.

[13]柳项.CRISPR/Cas9系统介导tyrp1b､chmp7､kank3在斑马鱼中的定点突变[D].太原:山西农业大学,2016.

[14]高莉,赵英虎,刘朝亮,等.酪氨酸酶相关蛋白1调控黑色素形成的研究进展[J].畜牧与饲料科学,2010,31(10):114–116,119.

[15]李春英.TRP-1在正常黑素细胞及恶性黑素瘤细胞中的作用研究[D].西安:中国人民解放军第四军医大学,2003.

[20]刘力,裴思然,吴华丽,等.基于tyrp1a转基因斑马鱼构建色素障碍性疾病药物筛选模型[J].中国药科大学学报,2016,47(6):740–743.

[22]郭稳杰,俞小牧,童金苟.鳙SOX基因克隆及序列进化分析[J].水生生物学报,2014,38(4):664–668.

[24]王成辉,项松平,吕耀平,等.瓯江彩鲤红､白两种体色遗传关系的初步研究[J].上海海洋大学学报,2008,17(4):402–405.

[26]郑雷,闫有圣,陈雪,等.一个Waardenburg综合征Ⅱ型家系SOX10基因的突变分析[J].中华医学遗传学杂志,2018,35(1):81–83.

[32]李康乐.瓯江彩鲤体色相关基因SOX10､Agouti､TYRP1､DCT的分子克隆与表达分析[D].上海:上海海洋大学,2014.

[34]徐伟,封竣淇,黄兰,等.TYR基因研究进展[J].中国畜牧杂志,2017,53(4):23–27.

[36]叶元土,吴萍,蔡春芳,等.灌喂氧化鱼油后黄颡鱼胃肠道黏膜黑色素细胞分化和黑色素合成途径基因的差异表达[J].水生生物学报,2018,42(1):57–66.

[40]张艳苹.红鳍笛鲷皮肤转录组分析及体色相关基因克隆､表达与进化研究[D].长沙:湖南师范大学,2016.

[41]李丽莎,李祥龙,周荣艳,等.MC1R基因编码区的系统发育分析和正选择位点检测[J].江苏农业科学,2016,44(3):44–48.

[42]封竣淇,徐伟,黄兰,等.MC1R基因的研究进展[J].中国畜牧兽医,2017,44(4):1141–1148.

[44]周康奇,宋红梅,潘贤辉,等.橘色双冠丽鱼体色相关基因MC1R的组织表达分析[J].动物学杂志,2019,54(1):45–56.

[46]朱春凤,冯永山.Agouti基因及其表达产物的结构与功能[J].黑龙江医药,2012,25(3):401–402.

[48]李英杰,唐家明,张磊,等.Agouti基因及其与动物毛色关系的研究进展[J].家畜生态学报,2015,36(9):85–89.

[49]殷浩然,罗明坤,王兰梅,等.锦鲤早期发育过程中色素代谢相关酶的活性和基因表达变化[J].南方水产科学,2019,15(5):109–117.

孟超,徐皓,黄超,李明明,宫晓婷,田光辉,孙钰,李宇飞,李慧,苏延友.鱼类体色相关功能基因的研究进展[J].湖南文理学院学报(自然科学版),2020,32(03):30-35.

基金:国家级大学生创新创业计划项目(201510439009,20161043927);山东省医药卫生科技发展计划项目(2018WS-139);泰安市科技局项目(2018NS0098).