1、感受态细胞的起源、概念及原理

1970年MANDEL和HIGE[1]发现大肠杆菌细胞经CaCl2溶液处理时能够吸收λ噬菌体DNA,细胞这种能够吸收DNA的状态称感受态。使用理化方法诱导细胞,改变细胞膜状态,增强细胞膜的通透性,细胞膜表面性状发生暂时性改变,方便外源基因或者载体进入受体细胞,这种处于最适摄取和容纳外来DNA状态的细胞称为感受态细胞(competentcell)。由于细胞膜具有流动特性,细胞膜通透性随后会逐渐自动修复。转化(transformation)是指同源或异源的“裸露”分子被感受态细胞摄取并使其基因型和表现型发生相应变化的现象得到表达。

2、感受态细胞制备常用方法及优化研究

2.1 化学法制备大肠杆菌感受态细胞及影响因素

2.1.1 CaCl2法

CaCl2法是制备大肠杆菌感受态细胞最常用的化学方法。此法操作简单,重复性好,但影响因素较多,若不注意细节和条件容易导致实验失败。

培养时间和转速的影响:挑取新鲜平板大肠杆菌菌落置于LuriaBertani(LB,pH6.5)培养液中,置于37℃摇床培养至OD600值最佳生长密度。吴海燕等[2]报道不同转速下大肠杆菌OD600值达到0.3～0.4所需的时间:200～220r·min-1振荡培养3～3.25h;240～260r·min-1振荡培养2.75～3h;280～300r·min-1振荡2.5～2.75h培养的细菌制备的感受态细胞转化效率可达(6.45±0.05)×107CFU·μg-1质粒DNA,可满足大部分质粒常规克隆的需要。宴国洪等[3]指出大肠杆菌DH5α菌种活化2次及以上OD600值为0.37～0.4时,细菌处于最理想的生长状态,被诱导处于感受态的细菌最多,但OD600值过高会导致细菌大量老化,活力显著减弱,转化率下降。

Ca2+终浓度和热激时间:经CaCl2处理过的细胞处于膨胀状态,过快过久的离心会损伤细胞。利用0℃低温预冷的CaCl2溶液悬浮沉淀菌体,再冰浴、离心,大肠杆菌包膜表面被Ca2+覆盖,可使重组体基因在不断增殖分裂的菌体中得到表达。Ca2+终浓度是维持细胞膜通透性的关键因素,Ca2+浓度在100mmol·L-1时,质粒的转化效率最高,而大肠杆菌摄取DNA的能力则不受转化前是否经过Ca2+处理的影响[4]。李文化等[5]认为大肠杆菌感受态细胞转化效率与Ca2+浓度呈正相关,在5mmol·L-1的低浓度中也可以完成转化。细胞膜上的脂质阵列被破坏并结合膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物,在低温低渗的菌体表面膨胀成球形,非生理条件下,高浓度的Ca2+附着于细胞表面改变细胞壁通透性,外源DNA则更容易接近细胞膜。此外,少量的Ca2+进入细胞后与细胞内部的聚-β-羟丁酸(poly-β-hydroxybutyrate,PHB)和磷酸基团结合形成复合物,此体系的细胞在经过42℃热激后,细胞膜的液晶结构会发生扰动,随后出现间隙,外源DNA被吸收,宿主细胞膜通透性发生改变[6]。代军等[7]在进行DH5α感受态细胞转化设置热激时间梯度时发现,42℃热激100s可出现超过5×106CFU·μg-1质粒DNA的转化效率,随后延长热激时间,转化效率降低。冷却时间对感受态细胞的转化效率影响不大,许彤等[8]在制备JM109感受态细胞时,在OD600为0.705的条件下采用TB转化液进行制备,42℃热激45s后,使用SOC培养基振荡培养后得到的感受态细胞转化效率可达8.59×108CFU·μg-1质粒,随后延长热激时间转化效率降低,表明热激时间过久不能提高转化效率。大肠杆菌的转化效率受多种因素制约,其中一个因素是细菌细胞应处于对数生长早期,生长过度或发育不全的细菌制备感受态细胞转化效率较低。

培养基的选择:SOC培养基中含多种营养物质,可在外源DNA导入感受态细胞时为菌体提供大量营养,供细菌快速生长繁殖[9]。虽然SOC培养基营养物质较LB培养基丰富,但对复苏电击后菌液细胞的转化效率并无明显影响[22]。

2.1.2 一步法

一步法也称TSS法,较CaCl2法快捷简便,不需要热休克,更方便易行。1989年CHUNG等[10]研究报道,在原有的CaCl2法基础上进行改进:在LB培养液中加入1×TSS(10%PEG,5%DMSO,10%甘油,MgCl2,MgSO4)贮存溶液。冰浴后加入DMSO菌液可降低细胞毒性并延长感受状态。代红星等[11]认为TSS法在常温下离心1min便可达到与CaCl2法相当的转化效率,短时离心也降低了细胞损伤。优化后的培养液中含有聚乙二醇(PEG)和MgCl2,二者均可沉淀质粒DNA,PEG使细胞壁具有方便DNA进入的生物学性能。张迹等[12]发现TSS法制备大肠杆菌感受态细胞时,分子量较小的质粒(pUC19)获得的转化效率高于分子量大的质粒(pET29a和pET29a-gfp)。研究发现使用TSS法制备大肠杆菌BL21菌株感受态细胞的最优转化条件为:转化体系冰水浴30min,再取出样品置于室温中放置10min,加入适量新鲜LB培养基后置于37℃、150r·min-1摇床中振荡复苏40min,涂布抗生素平板,最后37℃过夜培养筛选转化子。

2.1.3 甘油-聚乙二醇法

甘油-聚乙二醇法(Glycerin-PEG,G-PEG)属于高效感受态细胞制备方法,利用化学试剂在低温下与细菌质膜的相互作用,增加膜表面通透性,降低外源基因进入细胞内部难度,在一定条件下使外源DNA进入受体细胞[13]。G-PEG法比CaCl2法更容易在0℃低温下保存感受态细胞,相较于CaCl2法,G-PEG法存储液中多了甘油、葡萄糖保护剂,-30℃以下也可使感受态细胞保存至少180d,其机制可能为含有少量水分的结晶化合物和部分胶态物质的结合可以对菌种产生更好的保护作用,PEG作为一种多糖类物质在促进细胞膜和质粒DNA结合的过程中发挥重要作用[14]。黄学娟等[15]将高分子量的PEG应用于感受态细胞的转化中,在28℃培养细菌至OD600值为0.6时,感受态细胞的转化效率随PEG4000浓度的增加而提高,PEG4000浓度高于0.5%时,转化效率下降,PEG4000的最适浓度为0.5%。质粒转化时,黏合剂的使用有利于质粒DNA贴附于感受态细胞,以便热激时能够进入细胞,提高感受态细胞的转化效率。此外,黄学娟等[15]首次将有机硅表面活性剂SilwetL-77用于大肠杆菌感受态细胞的转化,SilwetL-77的加入可以显著提高大肠杆菌感受态细胞转化效率。0.0015%的SilwetL-77为质粒pUC19转化的最佳条件,0.002%的SilwetL-77为质粒pBI121转化的最佳条件。杨坤等[16]研究发现DMSO的保存效果优于甘油,以DMSO作为大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞冻存保护剂在-80℃超低温条件下可以保存60d,其转化效率依然达到1.1×107CFU·μg-1。

RAJAGOPAL等[17]对一步法进行改进,使用含有十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的缓冲液制备大肠杆菌感受态细胞,转化过程简单易行,且重复性高,含CTAB的缓冲液可以更有效摄取质粒DNA并连接反应产物。将细胞与1～10μg·mL-1CTAB混合,孵育,缓冲液洗涤,剩余未使用的感受态细胞可以冷冻在10%甘油中。转化时,将质粒DNA和细胞混合并在4℃下孵育5～60min,此时孵育时间变化对后续过程影响不大,并且无需加热脉冲。1μg·mL-1的CTAB最适合转化且具有抗性,5～10μg·mL-1的CTAB会破坏大肠杆菌的细胞壁,细胞壁通透性越高,摄取DNA能力越强,该方法快速高效,可以产生105～109CFU·μg-1质粒DNA。

2.2 物理法制备大肠杆菌感受态细胞

2.2.1 电转化技术

电转化技术(electrotransformationtechnology)也被称为电穿孔技术,是利用电脉冲瞬时电击细胞膜提高其通透性,促进大分子或亲水性分子进入细胞的方法,最早用于将DNA导入真核细胞。该法效率高,结果稳定。电转化技术可以满足构建大容量基因文库和抗体库的需要,瞬间电击脉冲可以使细胞表面出现暂时性小孔,电击作用使孔隙通道变大,促进细胞融合,方便外源DNA进入。但电转化技术受到诸多条件影响,如电场强度、脉冲时间、质粒DNA生长状态等。

感受态细胞生长状态:早于或晚于对数生长期的细胞在进行电转化时转化效率均不理想,增加供体细胞数量也可以提高转化效率[18]。OD600值维持在细胞对数生长早中期时最宜制备感受态细胞[19,20]。对数生长晚期的细菌发生老化,随OD600值增加转化效率降低。电转化效率和质粒DNA含量在一定程度上成正比,过量或体积过大的质粒DNA不能提高转化效率。

电场强度:电场强度对DNA和细胞影响较为复杂。在DNA和细胞接受电脉冲的早期,两者由随机分布转为向阳极运动,而晚期的DNA则分布于细胞外膜或胞质间隙,DNA进入细胞胞浆则是在37℃孵育过程中,虽然高场强的电脉冲可以完成这个过程,但电荷累积到一定程度的低场强也可以使细胞膜表面形成孔道,但此状态下的细胞由于内含物质外流极易死亡[21],因此适当的脉冲强度可以在保证细胞状态良好的同时提高转化效率,否则过高的电场强度会使部分细胞在大量外源生物大分子物质涌入后由于不能承受过高的场强而破裂死亡,造成无效转化。刘麒等[22]在研究大肠杆菌TG1对pDJ01质粒的电转化条件时摸索出最适电压为1800V、电容25μF、电阻200Ω,此时对细胞损伤最小,转化效率最高。4℃以下的低温环境收集感受态细胞和进行电穿孔有助于获得更高的转化效率,推测低温转化有助于维持细胞存活率,减少电击对细胞造成的热损伤。此外,低温下的细胞活性降低,对外界刺激的敏感性也随之降低,有利于细胞膜形成的孔隙开启时间延长,使更多的外源DNA进入[23]。

2.2.2 超声波转化

随着功率超声波设备的发展,依赖于声孔效应的超声波转化逐渐发展成为一种较理想的微生物转化技术。存在于液体中的微气核空化泡在声波的作用下振动,当声压达到一定值时会发生急剧崩溃,在强大的拉应力作用下将液体“撕开”成一空洞,这一过程称之为“超声波空化”。利用超声波技术可以使细胞膜和细胞壁表面产生许多可逆的空隙,瞬时破坏细胞膜后可以将药物或基因整合到活细胞中[24]。

超声波频率:2007年SONG等[25]首次在低频波段超声波40kHz,超声暴露时间10s,50mmol·L-1CaCl2,22℃,质粒浓度0.8ng·mL-1的条件下将质粒pBBR1MCS2转入革兰氏阴性菌DH5α、恶臭假单胞菌UWC1以及荧光假单胞菌SBW25,这一研究初步证实超声波介导的原核生物转化是可行的。YANG等[26]在申报专利中报道多种革兰氏阳性菌混合菌群的转化实验,发现化合物的直径应小于75nm,且化合物越小转化越容易;超声波最适转化频率为40kHz,这与SONG等的研究结果一致;最适电能值为0.05～0.20W/cm2;超声波转化过程持续时间至少5s,不能超过1min。孙尚琛[27]在利用超声波介导质粒pUC19转化DH5α感受细胞时将超声条件设置为35℃、40W、OD600值为0.4～0.6、25s,转化效率可达1.006×107CFU·μg-1质粒DNA,超出一般化学转化法的转化率。

细胞膜通透性与DNA质粒浓度:细胞壁成分肽聚糖(PG)与二价金属离子结合可以为外源DNA进入菌体开辟通道,但PG与二价金属离子(Ca2+、Mg2+)并非特异性吸附,一价金属离子(Na+、K+)也具有类似的吸附作用,这与之前报道的PG只与二价金属离子吸附并不完全符合[28]。经超声波处理过的感受态细胞表面出现凹凸不平的褶皱,大小不均一,虽然细胞膜通透性发生改变,但转化效率的改变与细胞膜通透性变化并不成正比,超声波介导外源DNA进入宿主细胞并非完全是细胞膜通透性改变的结果,细胞膜通透性改变只是解除外源物质进入胞体的通道屏障。张慧等[29]在研究大肠杆菌BL21(DE3)的转化条件时发现,OD600值为0.6、超声场强设置为400W、质粒浓度在0.01～0.20g·L-1,转化效率随DNA量的增加而呈明显上升趋势;DNA质粒浓度达到0.2g·L-1以后,转化效率的上升趋势趋于平缓,转化效率高达1.3×103CFU·μg-1质粒DNA。

3、影响大肠杆菌感受态细胞制备与转化的不利因素

为提高大肠杆菌感受态细胞的转化效率,除不断优化转化参数和实验条件外,还需避免影响制备和转化的不利因素。宴国洪[3]在对大肠杆菌DH5α进行转化时发现,过久过快的离心易造成部分细胞损伤,从而降低转化效率,所以不能一味追求沉淀效果而过快过久的离心。使用CaCl2法制备感受态细胞时需注意CaCl2溶液的处理方式,高温灭菌的CaCl2溶液并不能有效去除溶液中的杂质,反而容易导致溶剂减少,形成沉淀物,影响溶液pH值;过滤后的CaCl2溶液可避免上述缺点,所以保持液体的稳定性、防止污染对提升转化效果十分重要。为减少分装过程中产生的污染,将常规50mL大容量的离心管改成1.5mL的EP管,可在防止污染的同时提高转化效率,节约成本[7]。低温可以延长感受态细胞的保存时间,温度越低保存时间越久,但长期低温冻存会明显降低菌体细胞后期使用时的转化效率,所以在制备感受态细胞时应尽量避免过久冻存而影响转化效果[16]。

4、结语

外源质粒转化宿主细胞已成为基因工程及DNA克隆技术发展的基础与核心,是现代分子生物学实验室常用的技术手段,以上是实验室制备和转化大肠杆菌感受态细胞的常用方法,此外还有RbCl(氯化铷)法、Inoue法等。各种方法都有各自的优缺点,各实验室在制备和转化大肠杆菌感受态细胞时应根据自己实验室情况和实验目的选择低耗高效的方法,以最低成本制备出符合要求的大肠杆菌感受态细胞。

参考文献：

[2]吴海燕,谢应桂,何雄斌,等.快速准确制备大肠杆菌高效感受态细胞中有关OD600值的探讨[J].湘南学院学报,2006,8(3):13-15.

[3]晏国洪,姜山.长期保存活力低下的大肠杆菌制备感受态细胞条件的优化[J].江苏农业科学,2015(5):46-48.

[4]梅运军,陈向东,谢志雄,等.Ca2+对诱导大肠杆菌摄取外源DNA的影响[J].武汉大学学报(理学版),2012,58(4):354-358.

[5]李文化.Ca2+诱导大肠杆菌摄取外源DNA的研究[D].武汉:武汉大学,2004.

[7]代军.大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[J].江苏农业科学,2015,43(4):53-54.

[8]许彤,刘钦松,张丛丛,等.高效JM109感受态细胞制备及转化条件的优化[J].湖北农业科学,2012,51(21):4902-4904.

[11]代红星,张庆桥,樊宝良.一种简捷有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法[J].安徽农业科学,2008(29):12627-12628.

[12]张迹,李智,张宇,等.一步法制备大肠杆菌BL21(DE3)菌株感受态细胞及转化条件优化[J].江苏农业科学,2016,44(12):529-532.

[13]钟杰,左泽彦.菌种保藏方法研究[J].山东化工,2018,47(7):60-61.

[14]何正文.超声波介导的大肠杆菌转化技术研究[D].镇江:江苏大学,2015.

[15]黄学娟,张金迪,张壮,等.一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法[J].基因组学与应用生物学,2017,36(12):5199-5204.

[16]杨坤,巩振辉,李大伟.大肠杆菌高效感受态细胞的制备及快捷转化体系的建立[J].北方园艺,2010(14):127-130.

[19]张晓楠,肖玉,黄勇,等.影响大肠杆菌电转化效率因素的探讨[J].中国现代医学杂志,2008,18(4):466-468.

[20]王宋平,钱桂生,李玉英,等.电穿孔法介导质粒DNA转化大肠杆菌XL1-BlueMRF菌株的实验研究[J].四川医学,2008(2):134-137.

[22]刘麒,王阔鹏,于凌娇,等.电转化条件对大肠杆菌TG1转化效率的影响[J].吉林农业科技学院学报,2018,27(3):12-15.

[23]邓婷婷,李晖,刘燕.外源质粒电击转入Pseudomonasputida的条件研究[J].中国生物工程杂志,2009,29(8):81-85.

[27]孙尚琛.超声波介导质粒pUC19转化大肠杆菌DH5α感受态细胞转化方法及机制的研究[D].兰州:兰州理工大学,2016.

[29]张慧,杨胜利.大肠杆菌超声波转化条件研究[J].上海化工,2016,41(1):5-8.

郭梦姚,吴靖芳.大肠杆菌感受态细胞制备及转化研究现状[J].河北北方学院学报(自然科学版),2020,36(08):44-48.