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大鼠牙本质发育过程中果蝇裸露角蛋白2的表达分析

2020-08-15 161 上传者：管理员

摘要：目的明确果蝇裸露角蛋白2(Nkd2）在大鼠下颌第一磨牙牙本质发育过程中表达。方法取出生后1d、3d、5d、7d、9d的SD乳鼠下颌骨制作石蜡切片免疫组化染色，倒置显微镜观测Nkd2在大鼠牙胚中的表达；体外培养大鼠牙乳头细胞并采用细胞免疫组化染色进行组织来源鉴定，诱导其成牙本质向分化后茜素红染色，荧光定量RT-qPCR和Westernblot检测Nkd2在此过程中的表达变化趋势。结果免疫组织化学染色显示Nkd2在牙乳头、成牙本质细胞层和成釉细胞和牙囊中均阳性，在牙本质形成早期的成牙本质细胞层中强表达，随后减弱。Nkd2在大鼠牙乳头细胞中的表达呈阳性，矿化诱导4周后茜素红染色显示有矿化结节形成。荧光定量RT-qPCR和Westernblot检测显示矿化诱导培养过程中Nkd2的表达呈先上调后下调趋势。结论 Nkd2在大鼠牙胚组织中的表达分布具有时空特异性，体外大鼠牙乳头细胞诱导成牙本质细胞向分化过程中，Nkd2表达呈先上调后下调的趋势，推测Nkd2可能在牙本质形成早期发挥作用。

关键词：
Wnt/β-catenin信号通路
大鼠牙乳头细胞
果蝇裸露角蛋白2
牙本质形成
牙齿发育
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Nkd(nakedcuticle）果蝇裸露角质蛋白的哺乳动物同源物家族包括Nkd1(nakedcuticlehomolog1）和Nkd2(nakedcuticlehomolog2），是Wnt经典信号通路中的可诱导型抑制因子。其中Nkd2通过阻止β-catenin在细胞核内积累拮抗Wnt经典信号通路[1]。Wnt经典信号通路对牙齿发育的调控作用至关重要。本研究通过检测Nkd2在大鼠下颌第一磨牙发育过程中的时空表达变化及大鼠牙乳头细胞体外成牙本质向分化过程中的表达，探讨Nkd2在牙本质发育过程中的作用，为实现组织工程牙本质再生提供安全可靠的信号通路调控因子。

资料和方法

α-MEM培养基（Gibco，美国）；特级胎牛血清FBS(Gibco，美国）；维生素C(Sigma，美国）；β-甘油磷酸钠（Sigma，美国）；地塞米松（Sigma，美国）；茜素红（广州赛业生物科技有限公司）；RT-qPCR试剂盒（Roche，瑞士）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海博彩生物技术有限公司）；硝酸纤维素膜（MerckMillipore，美国）；超敏ECL化学发光试剂盒（MerckMillipore，美国）；超净工作台（Heraeus，德国）；CO2培养箱（Heraeus，德国）；倒置显微镜（Zeiss，德国）；正置显微镜（Zeiss，德国）；ABI7500全自动荧光定量PCR仪（ABI，美国）。

本项研究动物实验获得汕头大学动物伦理委员会审批（批准号：SUMC2017-050）。取出生后1d、3d、5d、7d、9d的SD乳鼠（汕头大学实验动物中心提供），颈椎脱臼法处死分离下颌骨，4%多聚甲醛4℃固定24h,EDTA脱钙液3d～7d，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5μm连续切片。脱蜡和水化，抗原修复后加一抗1:50稀释的羊抗鼠Nkd2多克隆一抗（SantaCruz，美国），覆盖组织，4℃孵育过夜。甩干后滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。DAB显色，细胞核复染，脱水封片。倒置显微镜下观察，拍照。阴性对照组使用PBS替代，其余处理同对照组。

取出生5～7d的SD乳鼠（汕头大学实验动物中心提供），颈椎脱臼法处死75%酒精浸泡2min；分离下颌骨置于含青链霉素双抗的PBS缓冲液，体式显微镜下分离第一、二磨牙牙胚，体式显微镜下仔细分离出牙乳头，含10%FBS的α-MEM培养基中剪碎，离心5min；弃上清加入I型胶原酶2mL,37℃消化20～30min，终止消化，离心5min；弃上清以含20%FBS及2%双抗的α-MEM培养基1mL重悬沉淀，接种于25cm[2]培养瓶，于37℃，5%CO2培养；24h后添加20%FBS的α-MEM培养基3mL。待细胞生长到80%融合采用胰蛋白酶差速消化法传代纯化大鼠牙乳头细胞，每3d更换含10%FBS的传代培养基，取P3～P5代细胞进行实验。将大鼠牙乳头细胞以10[5]/mL密度接种于六孔板，待细胞80%联合后，换用矿化诱导液（含10nmol/Lβ-甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸、10nmol/L地塞米松和10%FBS的α-MEM)[3]，每3d更换一次。

将生长良好的P3代大鼠牙乳头细胞以3×10[5]/mL密度，每孔400mL，接种于48孔板；24h贴壁后4%多聚甲醛固定60min,3%H2O2室温孵育10min,5%BSA封闭液，室温下孵育20min，弃去多余液体；分别滴加波形丝蛋白（1:100）、角蛋白（1:100）单克隆抗体（武汉博士德技术有限公司）和Nkd2一抗，4℃冰箱孵育过夜，滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）20～37℃孵育20min,DAB显色，苏木素复染；倒置显微镜下观察，拍照。阴性对照组使用PBS替代，其余处理同对照组。

大鼠牙乳头细胞在矿化诱导液中连续培养28天，弃原培养液，4%多聚甲醛固定10分钟，茜素红37℃下15分钟，自来水冲洗，光镜下观察矿化结节形成情况。

P3～P5代大鼠牙乳头细胞，接种于六孔板内，待细胞80%联合后加矿化诱导液培养，分别于0w（矿化诱导前）、1w、2w、3w、4w提取细胞总mRNA，测定RNA样本浓度和纯度，于PCR仪进行逆转录反应生成cDNA。根据GeneBank数据库中大鼠Nkd2的mRNA序列Forward:5’-GGGGCACAAGAAGCACAAG;Reverse:5’-GTGGGGTTTAGGGCTGATAGAA，采用PrimerPrimer5.0软件设计扩增引物，由谷歌生物技术有限公司合成。以cDNA为模板ABI7500全自动荧光定量PCR仪扩增目的基因片段。运行LightCycler480软件，选择SYBRGreen模式，反应体积20μL，反应条件如下：94℃预变性2min;94℃变性20s,58℃退火20s,72℃延伸20s，共40个循环；熔解曲线分析：温度62℃～95℃，每样本重复3次。按照2-△△Ct方法分析数据。其中△Ct=（目的基因Ct-内参基因Ct）的平均值±标准偏差；△△Ct=（待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct）的平均值±标准偏差。相对样品初始模板量=（2-△△Ct）的平均值±标准偏差。

取P3～P5代大鼠牙乳头细胞，5×10[5]/mL接种于六孔板，每孔2mL。24h后更换为矿化诱导液，每3d换液，分别于0w（矿化诱导前）、1w、2w、3w、4w后弃原培养液，提取总蛋白。BCA法测样本总蛋白浓度，并加入3×loadingbuffer,99℃变性蛋白10min,-20℃保存备用。灌胶与上样，80V恒压电泳30min,120V恒压继续电泳1h，转膜。5%脱脂牛奶稀释Nkd2一抗（1:100),4℃孵育过夜。TBST3000倍稀释二抗，室温孵育30min。将ECL发光液A与B以1:1比例避光混合，置于PVDF膜目的蛋白区，室温避光孵育1～2min，放入ImageQuantLas4000mini超敏化学发光成像仪，根据不同的光强度调整曝光条件，采集并保存图像。ImageJ软件进行蛋白条带灰度值测量与分析。目的蛋白相对表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。

各组细胞样品中Nkd2mRNA和蛋白表达的组间数据差异比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），利用SPSS11.0软件进行分析，P<0.05为有显著差异。

结果

免疫组化结果显示Nkd2在大鼠牙胚中的表达的表达随着时间推移而变化。出生第1天，大鼠牙胚组织处于帽状发育期，牙乳头和成釉器中Nkd2呈阴性表达，牙囊中阳性，且在根部的牙囊和牙槽骨中呈强表达（图1A-B）；第3天牙胚组织处于钟状晚期，牙冠开始形成，可见高柱状分泌活跃的成牙本质细胞和成釉细胞层，牙乳头和成牙本质细胞中Nkd2表达开始表达，成釉细胞中Nkd2呈阳性，牙囊细胞层阳性（图1C-D）；出生后第5天的大鼠牙胚处于牙冠形成期，牙釉质和牙本质层增厚，Nkd2在牙乳头、成牙本质细胞层和成釉细胞和牙囊中均阳性（图1E-F）；第7天牙冠形态基本形成，牙乳头和成牙本质层中Nkd2的表达减弱，牙囊细胞层仍呈阳性（图1G-H）；直至到第9天随牙本质厚度进一步增厚，牙乳头和成牙本质层细胞中Nkd2弱表达（图1I-J)

图1a出生后1-5天大鼠牙胚免疫组织化学染色

图1b出生后7-9天大鼠牙胚免疫组织化学染色

第三代大鼠牙乳头细胞（图1-2A）体外培养至80%联合进行免疫组化染色。细胞呈波形蛋白阳性（图2B）和角蛋白阴性（图2C），表明其组织来源为间充质，证明获得了纯化的大鼠牙乳头细胞。Nkd2在体外培养的P3代大鼠牙乳头细胞中呈弱阳性表达，主要分布于细胞质内（图2D）。

图2第三代rDPCs免疫细胞染色

体外培养的第三代大鼠牙乳头细胞生长至80%联合后矿化诱导液中连续培养4周，茜素红染色显示有矿化结节形成，表明牙乳头细胞已向成牙本质细胞方向分化（图3）。

分别收集矿化诱导液中连续培养0、1、2、3、4周的大鼠牙乳头细胞总蛋白和总RNA。Westernblot检测结果显示：矿化诱导培养过程中Nkd2蛋白的表达先上调后下调（图4A),RT-qPCR检测结果也显示Nkd2mRNA在前2周表达上调，后2周表达随时间逐渐减低（图4B）。

图3茜素红染色

图4Nkd2在rDPCs成牙本质向分化过程中的表达检测

讨论

哺乳动物牙齿的发育受到的Wnt信号通路直接或间接调控[2,3,4]。多项研究表明经典Wnt信号通路调控牙本质细胞和牙骨质细胞的增殖和分化从而调控牙根和牙齿发育异常[5,6,7,8,9,10]。

目前研究认为Nkd2是经典Wnt/β-catenin信号通路负性反馈调节抑制因子，对维持Wnt信号通路平衡状态具有重要意义[11,12]。激活Wnt/β-catenin信号通路，可上调NKD2的表达[13]。十四酰基化的Nkd2与DVL-1在细胞膜结合，导致二者降解，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路[1]。Masaru[14]研究发现Nkd2通过与Dvl-1结合，诱导Wnt/GSK3通路转向WNT/PCP信号通路，进而激活Wnt非经典信号通路，但妨碍了Dvl在经典信号通路中的作用。另有研究认为在斑马鱼胚胎发育中Nkd1/2同时拮抗wnt经典和非经典信号通路，并且在组织形成过程中Nkd2对于内源性wnt经典信号通路的限制作用是必需的[13]。此外，Nkd2可还与高尔基加工后TGF-α的胞质羧基端结合，将其由高尔基复合体运输至极化上皮细胞基底膜外侧，参与上皮细胞的极化[15]。Wnt/β-catenin信号通路与EGFR信号通路间通过Nkd2进行串话，Nkd2的下调能够激活Wnt经典信号通路，同时使TGF-α无法传递，提示其在细胞平衡和肿瘤形成中发挥作用[16]。基因芯片研究发现恶性外周神经鞘肿瘤中Nkd2表达高于正常对照，推测可能Nkd2的过表达引起β-cateinin的量减少，从而促进了细胞迁移和侵袭能力[17]。沉默或甲基化的Nkd2能够增强胃癌[18]，乳腺癌[19]和骨肉瘤[20]等多种恶性肿瘤的转移和侵袭。Nkd2对牙发育的作用研究尚未见报道。

Nkd1和Nkd2基因突变鼠出现颅骨发育异常，颅缝骨闭合缺失，鼻骨较短等表型特征[21]，表明Nkd2与口腔颌面部的硬组织形成密切相关。另有研究表明在小鼠松质骨改建过程中，甲状旁腺激素（PTH）可通过激活Wnt经典信号通路，上调Nkd2,Wisp1和Twist1的表达，促进成骨[13]。本研究发现Nkd2在发育过程中的大鼠牙胚有表达，且随时间推移其表达分布及强度均发生变化。出生第1天，大鼠牙胚组织处于帽状发育期，牙乳头和成釉器中Nkd2呈阴性表达，牙囊中阳性，且在根部的牙囊和牙槽骨中呈强表达（图1A-B），推测Nkd2参与了牙周及牙槽骨组织的形成，这与我们前期实验结果一致，Nkd2通过Wnt经典信号通路调控牙囊细胞分化从而调控牙骨质和牙槽骨的发育[22]；第3天牙胚组织处于钟状晚期，此时牙冠开始形成，牙乳头和成牙本质细胞中Nkd2表达开始表达（图1C-D）。直至7天牙冠形态基本形成，牙乳头和成牙本质层中Nkd2持续表达（图1E-H）；随牙本质厚度进一步增厚，牙乳头和成牙本质层细胞中Nkd2弱表达（图1I-J）。根据以上Nkd2在大鼠牙胚组织中的时空分布可见在成牙本质细胞分化及牙本质形成早期Nkd2强表达，随后表达减弱，推测Nkd2可能参与调控牙本质发育并在其形成早期发挥作用。

FGF2诱导成牙本质细胞的成牙本质向分化过程中，Nkd2于细胞增殖阶段表达下调，而细胞分化化阶段表达增高[23]，与本研究结果相一致，提示Nkd2可能促进成牙本质细胞分化我们推测Nkd2可能通过Wnt经典信号通路参与调控牙本质发育并在牙本质形成早期发挥作用。

陈婵婵,廖志清,王勤,张叶,丁桂聪.果蝇裸露角蛋白2在大鼠牙本质发育过程中的表达[J].现代口腔医学杂志,2020,34(04):197-201.

基金:广东省自然科学基金(2017A030310595);深圳市知识创新计划基础研究项目(JCYJ20170303155435885)