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人肝星状细胞LX-2增殖和凋亡中草乌甲素对其影响研究

2020-09-08 258 上传者：管理员

摘要：目的：研究草乌甲素(bulleyaconitineA,BLA)对肝星状细胞LX-2增殖、凋亡以及相关凋亡蛋白表达的影响。方法：体外培养LX-2细胞,分别给予不同BLA浓度处理24h后采用CCK8法检测BLA对LX-2细胞的抑制率;流式细胞术检测LX-2细胞凋亡的情况;Westernblot法检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达量。结果：BLA对LX-2细胞有明显抑制作用,BLA能使LX-2细胞处于S期、G2/M的细胞明显减少,差异均有统计学意义(t=9.71、4.88,P<0.05),处于G1期的细胞显著增多,差异有统计学意义(t=9.71,P<0.05);使Bax、Caspase-3蛋白表达量增加,Bcl-2表达降低。结论：BLA可能通过促进Bax、Caspase-3表达,抑制Bcl-2表达抑制LX-2细胞增殖,促进其凋亡。

关键词：
凋亡
增殖
肝星状细胞
草乌甲素
蛋白表达
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肝纤维化是临床常见的一种肝脏疾病,病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、血吸虫病以及各种炎症诱因均可导致其发生[1,2]。肝纤维化早期为可逆病变,也是肝硬化的必经阶段,所以肝纤维化应早发现、早治疗,去除诱因,避免肝硬化及肝癌的发生[3]。研究表明肝星状细胞活化细胞外基质分泌增多为肝纤维化的中心环节,所以抑制肝星状细胞活化,诱导肝星状细胞凋亡成为肝纤维化的治疗关键[4]。炎症刺激是诱导肝星状细胞活化的重要因素,减轻或抑制炎症反应可缓解或逆转肝脏纤维化的发生。草乌甲素(bulleyaconitineA,BLA)别名滇西嘟拉碱,属于C-19型二生物碱,临床上作为风湿性关节炎、类风湿性关节炎、癌症疼痛等慢性疼痛止痛药[5,6]。研究表明BLA有很强的抗炎作用[7],本研究初次探讨草乌甲素对人肝星状细胞增殖及凋亡的影响。

1、材料与方法

1.1 实验细胞

实验选用人肝星状细胞系LX-2细胞,购自上海软拓科技有限公司。

1.2 试剂与仪器

BLA(美国Sigma公司)CCK8(美国Biolite公司);胎牛血清FBS、DMEM、0.25%胰酶(美国Gibco公司);7-AAD、PEAnnexinv(美国BDPharmingen公司);PI(美国Sigma公司);RNaseA(立陶宛Fermentas公司);Bax、Bcl-2、Caspase-3抗体(美国CellSignalingTechnology公司),96孔板、培养皿(美国Cornning);SHKE6000-8CE震荡仪(美国Thermo公司);血球计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司);酶标仪(瑞士Tecaninfinite公司);生物安全柜(美国Thermo公司);CO2培养箱(日本SANYO公司);荧光显微镜(日本奥林巴斯公司);离心机(德国Sartorius公司);流式细胞仪(美国Millipore公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

LX-2细胞为贴壁生长的细胞,采用含有10%胎牛血清及100kU/L青霉素和100mg/L链霉素的高糖DMEM完全培养基进行培养,24h更换一次培养液。细胞贴壁生长铺满培养皿80%左右时,0.25%胰酶消化,传代培养。

1.3.2 CCK8实验

体外培养肝星状细胞处于对数生长期的LX-2细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液,并计数,使细胞浓度调到5.0×107/L,以不同的BLA浓度(0、1.17、2.34、4.69、9.38、18.75、37.50、75、150、300、600μg/ml)作用24h和48h后,严格按照CCK8试剂盒说明书操作,避光酶标仪在450nm读取吸光度。计算24h及48h半抑制浓度(IC50)值。

1.3.3 实验分组

实验分为BLA组和对照(Ctrl)组,BLA组中BLA浓度根据CCK8实验结果设定浓度为18.75μg/ml,对照(Ctrl)组加入DMEM培养基进行培养。

1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的影响

待实验组与对照组LX-2细胞生长至铺满培养皿80%左右时,胰酶消化,4℃离心15min,收集细胞,将细胞浓度调到1×107/L,实验组与对照组各设三个复孔。分别采用AnnexinV-FITC双染和PI-FACS染色上机检测细胞凋亡及细胞周期分布情况。

1.3.5 Westernblot检测BLA对Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的影响

取对数期生长的LX-2细胞置于6孔板中培养皿中,加入10%的胎牛血清培养,待细胞贴壁后细胞饥饿24h,按照设定分组进行分组培养24h;收集实验组与对照组处理后的细胞,PBS洗涤细胞2次,4℃离心15min,吸出上清液,每孔加入SDS样品缓冲液100μl对细胞进行裂解,置于冰上;超声处理10～15s以完成细胞裂解,取20μl样品,在95～100℃下加热5min,放在冰上冷却4℃离心5min后取20μl上样到SDS-PAGE凝胶(10cm×10cm)上,然后电转至硝酸纤维素膜;采用BSA进行封闭2h;将膜和一抗置于10ml兔抗Bax、Bcl-2、Caspase-3(1∶2000稀释)稀释缓冲液中在4℃摇床孵育过夜;用15mlTBST洗涤3次,每次5min,加入二抗室温孵育2h,TBST洗膜3次,每次5min;最后采用ECL试剂盒曝光成像。

1.4 统计学处理

统计数据采用SPSS24.0进行分析,采用GraphPadPrism5作图,实验组与对照组数据以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,两组间差异采用成组比较的t检验进行分析,P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CCK8实验及IC50

不同浓度BLA(0、1.17、2.34、4.69、9.38、18.75、37.50、75、150、300、600μg/ml)作用24h和48h实验结果见图1,BLA作用24h的IC50值为20.89μg/ml,48h的IC50值为19.20μg/ml。当BLA浓度低于IC50时对LX-2细胞活力没有显著影响,所以后续研究BLA对LX-2细胞周期及细胞凋亡的影响,BLA浓度选取在安全浓度范围内的18.75μg/ml作为实验浓度。

图1CCK8实验检测BLA对LX-2细胞活性的影响

2.2 BLA对LX-2细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测BLA对LX-2细胞凋亡(见图2):相比对照组,BLA组凋亡数明显增多,差异有统计学意义(t=4.983,P<0.05)。

图2流式细胞仪检测BLA对LX-2细胞凋亡的影响

2.3 BLA对细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示(见图3):相比对照组,BLA组处于S期、G2/M的细胞减少,差异均有统计学意义(t=9.71、4.88,P<0.05),处于G1期的细胞增多,差异有统计学意义(t=3.85,P<0.05)。

2.4 草乌甲素干预LX-2后相关凋亡蛋白表达情况

Westernblot检测结果显示BLA组Bax、Caspase-3的表达明显升高,Bcl-2的表达明显降低,与对照组相比差异均有统计学意义(t=17.013、18.045、19.662,P<0.01)。说明BLA对LX-2细胞有明显的促细胞凋亡作用(见图4)。

图3BLA对LX-2细胞周期的影响

图4Westernblot检测Bcl-2、Bax和Caspase-3的表达

3、讨论

肝纤维化的发生主要是由肝星状细胞激活后增殖分化为肌成纤维细胞后分泌细胞外基质(ECM)量超过其分解量,在肝细胞内外大量蓄积导致的[8]。正常情况下肝星状细胞处于相对静止的状态,当肝细胞受到损伤分泌大量细胞因子后肝星状细胞才会被激活[9],而炎症是导致肝细胞损伤诱导其激活的重要因素,前期研究发现BLA有很强的抗炎作用[10],但是BLA能否直接对肝星状细胞产生作用尚不清楚。本实验选用已经原生化的LX-2细胞,通过CCK8实验观察BLA对LX-2细胞增殖影响,实验发现BLA可明显抑制LX-2细胞,24h培养半数抑制浓度(IC50)为20.89,48h培养半数抑制浓度(IC50)为19.20。采用流式细胞仪对对照组与BLA组细胞周期及细胞凋亡情况进行检测,结果显示BLA组细胞处于S期、G2/M的细胞明显少于对照组(P<0.05),处于G1期的细胞明显多于对照组(P<0.05);相比对照组,BLA组LX-2细胞凋亡数量也明显增多。

Bcl-2家族[11]和Caspase家族[12]是研究最多的与凋亡有关的两类蛋白。Bcl-2家族中Bcl-2起着抑制凋亡的作用,Bax为促凋亡蛋白,Bax和Bcl-2起着拮抗作用,细胞正常功能需要两者之间的平衡,Bax/Bcl-2比值指示细胞是否以及如何对凋亡信号作出反应[13]。研究表明Bcl-2介导的线粒体细胞色素C释放的阻滞可能通过Caspases-9和3的上调来缓解,从而拮抗了Bcl-2的作用,促进癌细胞的凋亡[14]。Caspase-3属于Caspase家族,是促凋亡最重要的中模剪切酶,Caspase-3是一种关键的调控因子,其抑制作用可显著抑制细胞凋亡[15,16],所以也常作为检测细胞凋亡的常用蛋白。Westernblot检测结果显示BLA组Bax、Caspase-3蛋白的表达明显增高,Bcl-2的表达明显降低,说明BLA可能通过上调Bax、Caspase-3蛋白下调Bcl-2蛋白促进LX-2细胞凋亡。

综上所述,本实验通过体外培养人肝星状细胞LX-2细胞,BLA干预LX-2细胞发现BLA有抑制LX-2细胞增殖促进细胞凋亡作用,通过Westernblot实验认为BLA可能能通过上调Bax、Caspase-3蛋白下调Bcl-2蛋白促进LX-2细胞凋亡。BLA为安全、廉价的天然产物,本研究首次探讨BLA对LX-2细胞增殖、凋亡的影响,其机制复杂,研究处于基础阶段。

参考文献：

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