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文章特点—

△间充质干细胞作为储备细胞具有分化成心肌样细胞潜能；

△研究中药单体丹酚酸B对骨髓间充质干细胞氧化损伤保护作用及促进其向心肌样细胞分化的作用机制；

△寻找出既可以抑制氧化损伤又可以促进间充质干细胞向心肌样细胞分化的药物。

文题释义：

Nrf2:Nrf2与细胞质中的Keap1结合，导致蛋白酶体降解。在应激暴露时，出现Keap1半胱氨酸修饰的特定模式。Keap1释放Nrf2，其转移到细胞核后与小Maf蛋白形成异二聚体复合物。该复合物识别位于细胞保护基因中的抗氧化反应元件的增强子序列，激活它的转录。

Keap1：是由624个氨基酸残基组成的二聚体蛋白质，主要位于细胞质中，Keap1的特定半胱氨酸残基修饰是氧化应激条件下细胞中蛋白质构象变化的原因，Keap1可与Nrf2结合阻止其进入细胞核。

随着人们生活水平的提高，急性心肌梗死的发病率和死亡率不断上升。心肌梗死后心肌细胞不能再生，只能被瘢痕组织替代，最终导致心室重构、心脏收缩功能障碍和慢性充血性心力衰竭。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，易于纯化和培养传代[1,2]。研究表明，骨髓间充质干细胞可以在体内和体外分化为心肌细胞或心肌样细胞[3,4,5]。大量研究表明氧化应激在动脉粥样硬化、高血压、心肌缺血再灌注损伤、心肌病等心血管疾病的发生、发展过程中起重要作用，抑制氧化应激可以减少心肌细胞凋亡。

丹酚酸B是丹参提取物中的主要水溶性成分之一，研究证实丹酚酸B对心肌梗死具有很好的保护作用[6]，同时也能够明显改善心肌缺血再灌注损伤[7,8]。刘莎莎等[9]研究表明丹酚酸B对心肌细胞氧化损伤具有保护作用。LV等[10]研究发现丹酚酸B与骨形态发生蛋白2可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化。该实验探讨丹酚酸B对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用，以及丹酚酸B对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。

1、材料和方法

1.1设计

细胞学体外实验。

1.2时间及地点

实验于2018年8月至2019年1月在南昌大学公共实验中心完成。

1.3材料

DMEM高糖培养基、胎牛血清(中桥新舟，中国)；CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)；丙二醛、超氧化物歧化酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax抗体(Abcam公司)；GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(北京中杉金桥)；ECL化学发光检测试剂盒(美国PierceBiotechnology公司)；丹酚酸B(大连美仑生物技术有限公司)；GATA4、cTnTmRNA引物(上海生工生物工程有限公司合成)；间充质干细胞-成骨细胞分化培养基、间充质干细胞-脂肪细胞分化培养基(中乔新舟公司)。

实验动物：4周龄清洁级雄性SD大鼠6只，体质量(90±10)g，由南昌大学动物实验中心提供，实验动物机构许可证号为syxk2015-0001。

1.4实验方法

1.4.1骨髓间充质干细胞的分离和培养

采用颈椎脱臼法处死大鼠，浸泡于体积分数为75%乙醇中10min，无菌条件下取双侧股骨、胫骨以及肱骨，置于无血清DMEM高糖培养基中，剪断双侧干骺端，暴露出骨髓腔，用1mL注射器吸取培养液反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液置于离心管中，800r/min离心10min，弃上清，用含体积分数为10%胎牛血清的完全培养液(体积分数为10%胎牛血清+1%青链霉素+DMEM高糖培养基)重悬细胞，于37℃，体积分数为5%CO2培养箱内培养，12h后换液，去除未贴壁细胞，之后每3d换液1次，当细胞长满培养瓶后传代，每隔3d换液1次，倒置显微镜观察细胞形态。

1.4.2骨髓间充质干细胞的多向分化潜能鉴定

取第3代骨髓间充质干细胞，分别加入间充质干细胞-成骨细胞分化培养基与间充质干细胞-脂肪细胞分化培养基进行培养，观察细胞形态的变化，诱导21d后分别进行茜素红染色与油红O染色并进行拍照。

1.4.3CCK-8法检测骨髓间充质干细胞增殖情况

将第3代骨髓间充质干细胞浓度调整为1×107L-1，接种于96孔培养板，每孔200μL，置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱进行培养，待细胞长满瓶底80%以上时每孔加入终质量浓度为0,50,100,150,200μg/L丹酚酸B培养24h，每孔加入10μLCCK-8继续培养4h，酶标仪检测490nm波长下吸光度值。

1.4.4骨髓间充质干细胞分组、造模及干预

取第3代对数生长期骨髓间充质干细胞，调整细胞浓度为1×108L-1，接种于96孔培养板，于37℃、体积分数为5%CO2培养箱培养24h，实验分为3组，空白组继续用完全培养液培养，模型组和丹酚酸B组在完全培养液中加入300μmol/L过氧化氢培养24h建立氧化损伤模型[11]，丹酚酸B组在造模同时加入200μg/L丹酚酸B干预。

1.4.5骨髓间充质干细胞中丙二醛、超氧化物歧化酶水平及细胞培养液中肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平

经过上述干预24h后提取各组细胞培养液及细胞裂解液，应用DirectDetect™Spectrometer-SampleMeasuring红外微定量分析仪直接检测蛋白浓度，按照试剂盒说明书要求对样品进行处理，测定丙二醛、超氧化物歧化酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平。

1.4.6Westernblot法测定骨髓间充质干细胞中Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax蛋白表达水平

经过上述干预24h后提取各组细胞总蛋白，进行蛋白定量，经SDS-PAGE电泳分离，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温孵育2h，加入Nrf2、Keap1、Bcl-2、Bax一抗工作液4℃过夜，稀释倍数均为1∶1000,TBS-T缓冲液洗膜5次，10min/次，加入二抗工作液室温孵育1h,TBS-T缓冲液洗膜5次，10min/次，采用ECL法显色，凝胶成像系统拍照并分析。

1.4.7RT-PCR检测心肌分化相关标记物GATA4、cTnTmRNA的表达

经过上述干预14d后提取细胞总RNA，采用TRIZOL法提取总RNA，按照反转录试剂盒说明将提取的总mRNA反转录成cDNA，然后按照试剂盒说明书采用两步法进行实时定量PCR检测，引物序列见表1。

表1|各基因引物序列

1.5主要观察指标

丹酚酸B在过氧化氢条件下对骨髓间充质干细胞的保护作用及向心肌细胞分化的影响。

1.6统计学分析

采用SPSS19.0进行统计学分析，所有数据用表示，进行单因素方差分析，P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。

2、结果

2.1骨髓间充质干细胞形态变化

原代培养24h后可见少量细胞贴壁生长，细胞呈纺锤形、三角形、多边形或不规则形等，形态差异比较大，传代到第2代培养24h可见细胞成簇生长，呈长梭形，突起较少，且形态差异较小，第3代培养24h可见细胞呈单一梭形，呈成纤维样，平行或放射状排列，可见极少量杂质细胞，见图1。

2.2骨髓间充质干细胞的多向分化潜能鉴定

骨髓间充质干细胞成骨诱导21d，细胞汇合时均呈多层重叠生长，细胞局部堆集成灶状，形成钙结节，茜素红染色可见橘红色钙盐，见图2A；骨髓间充质干细胞成脂诱导培养21d，油红O染色可见细胞内有红色脂滴，见图2B。

2.3丹酚酸B对骨髓间充质干细胞增殖的影响

由表2可见，50,100,150,200μg/L丹酚酸B均能促进骨髓间充质干细胞增殖，与0μg/L丹酚酸B组比较差异有显著性意义(P<0.05)，细胞吸光度值随丹酚酸B质量浓度升高而增加，后续实验选取200μg/L丹酚酸B进行干预。

表2|不同质量浓度丹酚酸B对骨髓间充质干细胞增殖的影响

表注：与0μg/L比较，aP<0.05

2.4骨髓间充质干细胞培养液中肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平

由表3可见，与空白组比较，模型组骨髓间充质干细胞培养液中肌酸激酶和乳酸脱氢酶水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B组骨髓间充质干细胞培养液中肌酸激酶和乳酸脱氢酶水平显著降低(P<0.05)，结果表明丹酚酸B能够明显降低过氧化氢引起的骨髓间充质干细胞损伤。

2.5骨髓间充质干细胞中丙二醛和超氧化物歧化酶水平变化

由表4可见，与空白组比较，模型组骨髓间充质干细胞裂解液中丙二醛水平均显著升高(P<0.05)且超氧化物歧化酶水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B组骨髓间充质干细胞裂解液中丙二醛水平显著降低(P<0.05)且超氧化物歧化酶水平均显著升高(P<0.05)，表明丹酚酸B能够明显降低过氧化氢引起的骨髓间充质干细胞脂质过氧化损伤。

2.6丹酚酸B对骨髓间充质干细胞Nrf2、Keap1与Bcl-2、Bax蛋白表达的影响

由图3可见，与空白组比较，模型组骨髓间充质干细胞Nrf2蛋白表达显著降低(P<0.05)，而Keap1蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B组骨髓间充质干细胞Nrf2蛋白表达明显升高(P<0.05),Keap1蛋白表达降低(P<0.05)。模型组及丹酚酸B组Bcl-2/Bax蛋白表达比值明显低于空白组(P<0.05)，且丹酚酸B组Bcl-2/Bax蛋白表达比值高于模型组(P<0.05)。结果表明丹酚酸B能够诱导骨髓间充质干细胞激活Nrf2-ARE信号通路相关蛋白的表达从而达到抗氧化用，并且在氧化损伤情况下丹酚酸B通过上调Bcl-2/Bax比值抑制骨髓间充质干细胞凋亡。

表3|骨髓间充质干细胞培养液中肌酸激酶、乳酸脱氢酶水平变化

表注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

图1|大鼠骨髓间充质干细胞原代培养形态学观察(×40)

图注：图中A为原代细胞，呈纺锤形、三角形、多边形或不规则形等，形态差异比较大；B为第2代细胞，呈长梭形，形态差异较小；C为第3代细胞，呈单一梭形，呈成纤维样，平行或放射状排列

图3|丹酚酸B对骨髓间充质干细胞Nrf2-ARE信号通路相关蛋白表达影响

图注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

2.7RT-PCR检测心肌分化相关标记物的表达

由图4可见，模型组GATA4、cTnTmRNA表达与空白组比较差异无显著性意义；与模型组比较，丹酚酸B组诱导14d后GATA4、cTnTmRNA表达明显升高(P<0.05)。

3、讨论

间充质干细胞作为储备细胞，可以替换损伤或衰老的细胞，氧化损伤可以改变骨髓间充质干细胞的活性，促进骨髓间充质干细胞的老化与凋亡。心肌细胞作为终末分化细胞，其再生极度缓慢困难。近年来的研究发现，心脏每年约有少量的心肌细胞可以完成自我更新，因而寻找有效抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤与促进分化心肌细胞的药物对改善心血管疾病有着重要意义[12]。

表4|骨髓间充质干细胞裂解液中丙二醛和超氧化物歧化酶水平变化

表注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

图2|骨髓间充质干细胞的成骨成脂分化潜能鉴定(×200)

图注：图中A为茜素红染色，可见橘红色钙盐；B为油红O染色，细胞内有红色脂滴

图4|RT-PCR检测细胞中GATA4、cTnT的表达

图注：与空白组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

活性氧是一系列化学性质活泼、氧化能力强的含氧物质的总称。生物体内活性氧的生成与清除处于动态平衡状态，当某种因素打破这一平衡而导致活性氧浓度超过生理限度时就会损伤生物大分子，导致细胞内ATP耗竭、Ca2+超载和细胞毒性，最终启动细胞功能障碍和凋亡[13,14,15]。因此，有效抑制线粒体活性氧的产生和过多的活性氧清除会减弱过氧化氢诱导带来的细胞凋亡。丹酚酸B组骨髓间充质干细胞培养液中肌酸激酶和乳酸脱氢酶水平与模型组比较显著降低，说明丹酚酸B可以抑制活性氧的积累以减少细胞凋亡。

与空白组比较，模型组骨髓间充质干细胞裂解液中丙二醛水平均显著升高(P<0.05)且超氧化物歧化酶水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B组骨髓间充质干细胞裂解液中丙二醛水平显著降低(P<0.05)且超氧化物歧化酶水平均显著升高(P<0.05)，表明丹酚酸B能够明显降低过氧化氢引起的骨髓间充质干细胞脂质过氧化损伤。

Nrf2/Keap1途径是机体应对氧化应激的内源性保护机制之一，已成为治疗肿瘤、神经病变、肺纤维化、糖尿病及其并发症的药物靶点。针对活性氧损伤，机体具有复杂的内源性氧化应激反应系统，可产生一系列保护性蛋白来缓解损伤，这种防御机制可以由特异的DNA启动子结合序列ARE介导，ARE可以启动许多下游抗氧化酶的表达。最近的研究证明Nrf2因子是该序列的激活子[16]。正常情况下，细胞中Nrf2的表达下调，主要依靠Keap1的泛素化和细胞质中蛋白酶体的降解。当被活性氧激活时，Nrf2进入细胞核，与ARE序列结合，激活多种抗氧化基因的转录，保护细胞免受过多的活性氧刺激[17,18]。Nrf2/ARE通路最近被确定为最重要的内源性抗氧化应激通路，可激活多种下游保护基因，如血红素加氧酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽系统酶、谷胱甘肽巯基转移酶及醌氧化还原酶1等[19]。研究表明，Nrf2/ARE通路激活可诱导抗氧化酶的产生，增强细胞清除活性氧的能力，以维持氧化还原平衡，减少氧化损伤。

与空白组比较，模型组骨髓间充质干细胞Nrf2蛋白表达显著降低(P<0.05)，而Keap1蛋白表达显著升高(P<0.05)；与模型组比较，丹酚酸B组骨髓间充质干细胞Nrf2蛋白表达明显升高(P<0.05),Keap1蛋白表达降低(P<0.05)。模型组及丹酚酸B组Bcl-2/Bax蛋白表达比值明显低于空白组(P<0.05)，且丹酚酸B组Bcl-2/Bax蛋白表达比值高于模型组(P<0.05)。结果表明丹酚酸B能够诱导骨髓间充质干细胞激活Nrf2-ARE信号通路相关蛋白的表达从而达到抗氧化用，并且在氧化损伤情况下丹酚酸B通过增加Bcl-2蛋白表达，降低Bax蛋白的表达来抑制骨髓间充质干细胞凋亡。

cTnT是心肌细胞特异性的表面标志物，GATA-4基因具有心脏特异性表达的特点，是心脏前体细胞分化的最早期标志之一，参与调节心肌细胞结构基因和调控基因的表达，还可与多种心肌基因调控区域结合，参与心肌细胞的分化过程。在心脏发育早期抑制GATA-4的表达将抑制前心肌细胞及分化终末期心肌细胞的发育，阻断原始肌管的形成；相反，增加GATA-4表达将加速心脏的发育，并明显增加分化末期搏动的心肌细胞数量[20,21,22,23]。实时荧光定量PCR检测显示，丹酚酸B组心肌转录因子GATA4、cTnT表达明显增加，说明丹酚酸B组能够明显促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。

综上所述，实验以骨髓间充质干细胞为研究对象，利用过氧化氢建立氧化应激损伤模型，发现在氧化应激损伤情况下丹酚酸B可以通过调节Nrf2/Keap1、Bcl-2与Bax相关蛋白表达，降低氧化损伤并促进骨髓间充质干细胞的存活，还可以提高骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的能力，这可能是缺血性心脏病的潜在治疗策略。

作者贡献：实验设计为孙贵才，实验实施、评估为裴丽丽，资料收集为王弟。

经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目(81960881,81660801)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验方案经南昌大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准，批准号为198。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计学方法已经通过南昌大学第一附属医院生物统计学专家审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

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裴丽丽,孙贵才,王弟.丹酚酸B抑制骨髓间充质干细胞氧化损伤及促进分化为心肌样细胞[J].中国组织工程研究,2021,25(07):1032-1036.

基金:国家自然科学基金项目(81960881,81660801),项目负责人:孙贵才.