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文章特点—

△建立了以人骨骼肌源性血管内皮细胞为滋养层的脐血造血干细胞体外培养体系；

△以培养前后脐血CD34+细胞数量变化、免疫表型及集落形成能力为指标，评估人骨骼肌源性血管内皮细胞对人脐血CD34+细胞的支持效力。

文题释义：

造血干/祖细胞：造血干细胞是具有自我更新、复制和多向分化潜能的原始细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源细胞。造血干细胞在特定微环境和某些因素的调节下，可增殖分化为各类血细胞的祖细胞，称为造血祖细胞。造血祖细胞也是一种原始的具有增殖能力的细胞，但失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化。

人骨骼肌源性血管内皮细胞：简称肌血管内皮细胞，是一种骨骼肌干细胞，其位于骨骼肌微血管内膜，共表达肌肉干细胞表面标记CD56，以及血管内皮细胞标记CD34、CD144，而不表达血细胞表面标记CD45(CD56+CD34+CD144+CD45-)。肌血管内皮细胞与间充质干细胞具有相似性，表达间充质干细胞表面标记物，具有多向分化潜能。

骨髓中主要存在造血干/祖细胞和间充质干细胞两种干细胞类型。机体的正常造血依赖于造血干/祖细胞以及支持造血细胞生长发育的骨髓微环境即间充质干细胞的相互作用[1]。大量研究显示骨髓间充质干细胞对维持造血干/祖细胞正常造血功能至关重要[2,3]，间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞，不仅参与构成骨髓造血微环境，还可表达多种造血相关因子[4]，在造血干/祖细胞增殖分化、成熟并最终进入血液循环过程中均发挥着重要作用。尽管许多学者进行骨髓间充质干细胞的培养扩增研究，但从骨髓获取间充质干细胞仍面临着取材危险性大、含量极其稀少以及缺乏特殊表面标记难以分离纯化等局限，远不能满足临床所需。因此，寻找骨髓来源以外的间充质干细胞是目前研究的热点。

除骨髓来源间充质干细胞外，肌肉组织作为人体最大的器官，占人体总质量的40%左右，取材相对简单安全。骨骼肌组织里储存有多种肌源性干/祖细胞)[5]，包括多能成年祖细胞、肌血管内皮细胞、肌血管外膜细胞和侧群细胞等[6]，各组细胞可依据不同的表面标记物结合流式细胞仪分选用于不同的用途[7]。研究表明肌肉组织来源的CD45+侧群细胞具有极强的造血分化能力，能向外周血的红系、粒系以及血小板分化[8]。ZHENG等[9]应用多参数流式细胞分选技术成功地在人体肌肉组织中发现并获取了一种位于血管壁的成人肌肉干细胞，这种细胞被命名为骨骼肌血管内皮细胞，共表达肌肉干细胞和血管内皮细胞的标记(CD56+CD34+CD144+)，培养后表达间充质干细胞的表面标志CD90、CD105、CD73、CD44，表现出向多谱系中胚层发育的潜能[10]。研究显示，内皮细胞能够促进血管生成[11,12,13]，人血源性内皮细胞及小鼠表达血管内皮细胞标记的肌源性干/祖细胞也被发现具有造血重建作用[8,14,15,16]，但成人肌肉来源肌血管内皮细胞无法向造血细胞分化。课题组前期进行的生物学鉴定验证人肌血管内皮细胞与间充质干细胞具有相似性[10]，然而人肌血管内皮细胞是否像骨髓间充质干细胞一样对造血干/祖细胞体外扩增具有支持作用需要进一步的研究。因此该实验的目的是研究人肌血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外扩增效力，首先将人肌血管内皮细胞作为滋养层与人脐血CD34+细胞直接接触共培养，并且与传统的人骨髓间充质干细胞为滋养层的共培养体系进行对比[17]，探讨人肌血管内皮细胞对人脐血CD34+细胞体外支持能力、造血细胞表面抗原表达及集落形成能力的作用，为寻找骨髓基质以外来源对造血干/祖细胞具有扩增作用的基质细胞奠定基础。

1、材料和方法

1.1设计

体外细胞学实验。

1.2时间及地点

实验于2017年3月至2019年1月在宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所完成。

1.3材料

1.3.1标本

人骨骼肌肉标本来源于宁夏医科大学总医院创伤骨科手术中清除的肌肉组织(n=14)；脐血标本来源于宁夏医科大学总医院产科足月健康分娩的新生儿脐血(每份脐血约80mL,n=15)。人肌血管内皮细胞利用多参数流式细胞术分选得到，并进行传代培养[10]。脐血CD34+细胞利用免疫磁珠法进行分选得到。实验方案均经宁夏医科大学总医院医学伦理委员会批准且捐献者及家属知情同意。

1.3.2实验试剂和仪器

成人骨髓间充质干细胞(Vyagen赛业生物公司)；丝裂霉素(Sigma公司)；MethoCultH4535EnrichedwithoutEPO(Stemcell公司)；小鼠抗人CD45-APC-H7抗体、小鼠抗人CD34-APC标记、小鼠抗人CD33-FITC标记、小鼠抗人CD19-PE-Cy7标记、小鼠抗人CD10-PE标记、小鼠抗人CD14-Alexa700标记、小鼠抗人APC-H7IgG1抗体、小鼠抗人APCIgG1抗体、小鼠抗人PEIgG1抗体、小鼠抗人FITCIgG1抗体、小鼠抗人Alexa700Ig2a抗体、小鼠抗人PE-Cy7Ig2b抗体、7-AADViaProbe、多参数流式细胞分选仪BDFACSAriaⅢ(BD公司)；胶原包被96孔培养板(Corning公司)；3mL注射器、注射器针头、MethoCultH4535EnrichedwithoutEPO(Stemcell公司)；瑞士-吉姆萨染料(珠海贝索生物公司)；40,70μm细胞筛网(Falcon公司)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司)；高糖型DMEM培养基、马血清(Gibco公司)；胎牛血清(BiologicalIndustries公司)；青霉素/链霉素(Invitrogen公司)。

1.4实验方法

1.4.1滋养层细胞与人脐血CD34+细胞直接接触培养

实验分为3组：实验组(人肌血管内皮细胞为滋养层)、对照组(骨髓间充质干细胞为滋养层)、空白对照组(无滋养层)。人肌血管内皮细胞在含体积分数为10%胎牛血清、体积分数为10%马血清、0.5%鸡胚提取物、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养，骨髓间充质干细胞在含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。取第3-8代人肌血管内皮细胞及人骨髓间充质干细胞，以细胞密度1.5×104/孔分别种于胶原包被的96孔板中，各设置3孔，加入人肌血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞培养基放置于体积分数为5%CO2、37℃饱和湿度培养箱中培养。待两种细胞培养24h贴壁之后用4mg/L丝裂霉素处理2h,PBS洗3次，每次间隔5min,24h之后将人脐血CD34+细胞以5×104/孔分别接种于人肌血管内皮细胞、骨髓间充质干细胞滋养层上，共培养的培养基为含体积分数为5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基。无滋养层空白对照组单独接种人脐血CD34+细胞5×104/孔，设置3个孔，培养基同上。

1.4.2扩增后人脐血CD34+细胞计数与流式细胞术检测造血细胞免疫表型

细胞培养至1,2,4周时，每孔细胞加入100µLTryple进行消化，分别收集实验组、对照组、空白对照组的悬浮人脐血CD34+细胞，锥虫蓝染色法计数人脐血CD34+细胞数量。造血细胞免疫表型检测：将上述获得的人脐血CD34+细胞加入鼠血清封闭(鼠血清∶细胞悬液体积比为1∶20)，冰上孵育30min；设置样本管：加入细胞浓度为1×108L-1的单细胞悬液200µL，将CD34-APC、CD45-APC-Cy7、CD33-FITC、CD19-PE-Cy7、CD10-PE、CD14-Alexa700各1µL加入样本管中，冰上孵育30min；设置对照管：加入细胞浓度为1×107L-1的细胞悬液100µL，将APC-、APC-Cy7-、FITC-、PE-Cy7-、PE-和Alexa700-结合的抗体各1µL加入同型对照管，冰上孵育30min；上机前加入7-AADViaProbe(每106-107个细胞加20µL)并在冰上孵育10min，送至上机检测。

1.4.3共培养后造血干/祖细胞集落培养、计数及血细胞形态学鉴定

细胞培养至1,2,4周时，收集实验组、对照组、空白对照组的悬浮人脐血CD34+细胞，锥虫蓝染色法计数人脐血CD34+细胞数量，细胞培养至第5周时因细胞全部死亡故未行检测。将3×103人脐血CD34+细胞接种至3mL甲基纤维素半固体培养基中充分混合，每35mm×10mm培养皿中加入约1.1mL上述混合物，设置3皿，置于37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养10-14d，在倒置显微镜下观察粒-巨噬系集落形成单位(colony-formingunitgranulocyte-macrophages,CFU-GM)形态并计数集落数量。在倒置显微镜下，用100µL移液枪吸取集落加入含有HBSS的EP管中，每个集落20-50µL，反复吹打混匀，甩片、瑞士-吉姆萨染色，玻片风干后在倒置荧光显微镜下用油镜观察细胞形态。

1.5主要观察指标

对扩增后第1,2,4周人脐血CD34+细胞数量、造血细胞免疫表型和造血干/祖细胞集落形成能力进行分析比较。

1.6统计学分析

采用SPSS23.0统计软件对样本进行数据整理和统计分析，计量资料以表示。各指标的分析比较采用配对样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1镜下观察以人肌血管内皮细胞为滋养层共培养的人脐血CD34+细胞

见图1。在倒置显微镜下观察，共培养1周后有滋养层组(实验组及对照组)人脐血CD34+细胞相对于无滋养层空白对照组人脐血CD34+细胞有明显扩增，无滋养层空白对照组人脐血CD34+细胞无明显扩增，且状态不佳，细胞皱缩。与对照组比较，以人肌血管内皮细胞为滋养层共培养的人脐血CD34+细胞轮廓更为清晰，胞质饱满透亮；共培养2周后，有滋养层组人脐血CD34+细胞密度相对于1周有所增加，且细胞生长良好，其中以人肌血管内皮细胞为滋养层共培养的人脐血CD34+细胞透亮清晰，显示出较好的活性，无滋养层空白对照组人脐血CD34+细胞锥虫蓝染色未见活细胞。共培养4周后，人脐血CD34+细胞密度相对于2周未见明显变化，但细胞轮廓不清晰。

2.2共培养扩增过程中人脐血CD34+细胞数量分析

共培养0d时3种共培养体系人脐血CD34+细胞数量相同，均为5×104。共培养1周，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数量略有增加，分别为(5.57±1.12)×104,(5.09±0.81)×104；共培养2周，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数达到高峰，分别为(6.93±1.97)×104,(5.50±0.71)×104；共培养至4周，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数逐渐减少，分别为(3.69±1.06)×104,(2.48±0.76)×104，实验组细胞存活数略高于对照组；随着共培养时间延长，人脐血CD34+细胞数量逐渐减少，于第5周时无细胞存活；空白对照组人脐血CD34+细胞数量迅速下降，于第2周全部死亡，见图2。经统计分析，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数量在1,2,4周差异均无显著性意义(P>0.05,n=5)，见表1。

2.3流式细胞术分析共培养过程中人脐血CD34+细胞的免疫表型

共培养1,2,4周使用流式细胞仪检测造血细胞标记物。CD45+为全血细胞标记，CD34+CD33-为造血祖细胞标记，CD10+/CD19+为淋巴细胞标记，CD14+为单核细胞标记，通过检测这些标记物表达量比较促造血能力异同，见图3。收集共培养1,2,4周时人脐血CD34+细胞进行计数，用流式细胞术检测人脐血CD34+细胞中CD45+、CD14+、CD10+/CD19+和CD34+CD33-的表达。在共培养第2周时，对照组人脐血CD34+细胞的CD34+CD33-表达率略高于实验组，差异有显著性意义(P<0.05,n=5)，其他的亚型免疫表型CD45+、CD14+、CD10+/CD19+表达在1,2,4周差异均无显著性意义(P>0.05,n=5)，见图4。由于空白对照组人脐血CD34+细胞第1周计数少，于第2周全部死亡，细胞数未能做流式分析要求，因此无法检测人脐血CD34+细胞免疫表型。

2.4造血干/祖细胞集落形成分析

共培养1,2,4周将共培养的人脐血CD34+细胞分别接种于甲基纤维素半固体培养基中培养14d，均可见粒-巨噬系集落形成，大于50个细胞的细胞团被计为1个集落，并对所形成的集落进行镜下计数，取平均值。吸取粒-巨噬系集落，进行甩片、瑞士-吉姆萨染色，在倒置显微镜下用油镜观察细胞形态，可观察到粒细胞、单核细胞等血细胞，且细胞轮廓清楚，核着色深，核质界限清楚，见图5。共培养第1周时集落数均为最多，随共培养时间延长，集落数量逐渐减少。共培养第1,2,4周时实验组集落数分别为121.25±13.90,36.13±13.86,3.88±3.39，对照组集落数分别为129.38±16.80,51.63±13.50,18.63±10.68。虽然对照组高于实验组，但差异无显著性意义(P>0.05,n=5)，见图6。空白对照组1周时收集人脐血CD34+细胞数量少，无法行集落培养实验。

3、讨论

目前，造血干细胞移植已成为临床上治疗血液肿瘤的主要手段[18,19,20]。造血干/祖细胞在血细胞的增殖分化和移植后的临床疗效中起着关键作用，近些年人脐血已成为造血细胞研究和移植的重要来源[21,22,23,24]。人脐血CD34+细胞在造血干细胞移植、体外扩增培养及基因治疗等方面都有广泛的应用[17,25]，然而这些干细胞的数量极低。因此，干细胞体外扩增是目前增加造血干/祖细胞数目用于移植的途径之一[26]。

表1|两组人脐血CD34+细胞数的统计分析

共培养系统模仿体内造血微环境，为维持和促进造血干/祖细胞分化提供了重要的环境支持[27]，骨髓间充质干细胞具有明显的支持造血功能，体外条件下可促进造血干/祖细胞增殖和分化，是迄今为止最有效的支持造血干细胞体外扩增的基质细胞来源[27,28]，但从骨髓获取间充质干细胞具有局限性，因此寻找非骨髓来源基质细胞变得尤为重要。

骨骼肌遍布全身、取材方便，这种优势使得骨骼肌有可能作为基质细胞的丰富来源。研究发现造血干/祖细胞可以促进肌肉损伤修复，将CD45+造血干细胞通过静脉移植入小鼠体内，小鼠骨骼肌组织中造血干细胞数量多的部位产生了骨骼肌纤维[29,30]；相反也有研究证实肌源性干/祖细胞能重建造血缺陷小鼠的造血功能，从而证明了肌源性干/祖细胞可以向造血干细胞分化[31]，血管内皮细胞也被证实在骨髓微环境中起到积极的作用[26]。经鉴定确认人肌血管内皮细胞与间充质干细胞存在相似性[10]，若同样作为基质细胞，人肌血管内皮细胞支持体外造血的作用值得研究。

该研究建立了以人肌血管内皮细胞为滋养层与人脐血CD34+细胞体外共培养体系，检测体外共培养过程中人脐血CD34+细胞数量、造血干/祖细胞集落形成、血细胞免疫表型等指标。以人肌血管内皮细胞作为滋养层同样可以支持人脐血CD34+细胞的体外扩增，且能较好地维持细胞状态及活性。对共培养扩增过程中人脐血CD34+细胞数量、集落形成等长期培养的功能性指标分析显示，空白对照组人脐血CD34+细胞在第2周大量死亡，实验组和对照组人脐血CD34+细胞数明显增高，且实验组略高于对照组，但差异无显著性意义。随着共培养时间延长，细胞数逐渐下降，实验组的细胞数下降程度略缓于对照组。随着培养时间的延长，对照组和实验组的CD14+细胞及CD10+/CD19+细胞表达逐渐增加，CD45+、CD34+CD33-的表达率随之减低，第1,4周时两组的CD34+CD33-表达率差异无显著性意义，仅在第2周对照组CD34+CD33+的表达率高于实验组，差异有显著性意义，但在造血干细胞功能实验中干/祖细胞集落培养显示，第1,2,4周两组的集落形成能力同样差异有显著性意义。研究表明人肌血管内皮细胞作为滋养层和人骨髓间充质干细胞为滋养层相似，在体外可维持造血干/祖细胞的干性并对造血干/祖细胞具有支持作用[17]。因此，该研究发现人肌血管内皮细胞是一种潜在良好体外扩增人脐血CD34+细胞的基质细胞，能够为造血干/祖细胞的扩增提供一个丰富的基质细胞来源。在后续实验中将进一步从细胞因子分泌等方面研究人肌血管内皮细胞的促造血机制，这将为未来应用造血干细胞移植的基质细胞来源提供一个新思路。

图1|倒置显微镜下各组人脐血CD34+细胞形态对比(×200)

图注：共培养1周时有滋养层细胞组(图A、D)相比于无滋养层细胞组(图G)的细胞数明显增加；无滋养层细胞组(图H)在第2周时全部死亡有滋养层细胞组(图B、E)在第2周时仍能维持较好的细胞状态；培养到第4周时，有滋养层细胞组(图C、F)的细胞轮廓欠清晰

图2|共培养前后人脐血CD34+细胞数的比较(n=5)

图注：共培养1周时，实验组和对照组人脐血CD34+细胞数量略有增加共培养2周达到峰值，且实验组细胞增殖速率大于对照组，随着共培养时间的延长，人脐血CD34+细胞数量逐渐减少，第5周几乎没有细胞存活。空白对照组人脐血CD34+细胞于第2周全部死亡

图3|流式细胞术检测共培养人脐血CD34+细胞的造血细胞表面标志物表达

图注：图中A和E显示实验组和对照组人脐血CD34+细胞均高表达CD45+;B和F为实验组和对照组人脐血CD34+细胞CD34+CD33-流式分析，在该流式图中Q1为CD34+CD33-;C和G为实验组和对照组人脐血CD34+细胞CD10+/CD19+流式分析，在该流式图中Q1-1+Q2-1+Q4-1为CD10+/CD19+细胞群；D和H为实验组和对照组人脐血CD34+细胞CD14+流式分析，在流程图中Q2-2+Q4-2为CD14+细胞群

图4|人脐血CD34+细胞的造血细胞标志物表达直方图

图注：实验组人脐血CD34+细胞仅在第2周时CD34+CD33-(B)表达率略低于对照组，差异有显著性意义(aP<0.05,n=5)，其他标志物CD45+(A)、CD14+(C)、CD10+/CD19+(D)表达在共培养第1,2,4周差异均无显著性意义(P>0.05,n=5)

图5|共培养后人脐血CD34+细胞的粒-巨噬系集落形态

图注：图中A为实验组人脐血CD34+细胞共培养14d时镜下观察粒-巨噬系集落形态(×100);B为瑞士-吉姆萨染色后在油镜下进一步观察实验组粒-巨噬系集落形态(×1000);C为对照组人脐血CD34+细胞共培养14d时镜下观察粒-巨噬系集落形态(×100);D为瑞士-吉姆萨染色后在油镜下进一步观察对照组粒-巨噬系集落形态(×1000)

图6|不同培养体系形成的粒-巨噬系集落形成单位柱状图

图注：第1,2,4周集落数逐渐降低，3个时间点差异均无显著性意义(P>0.05,n=5)

作者贡献：实验设计为通讯作者，实验实施为第一、二、三、四作者；实验评估为通讯作者、第一作者及第三作者；资料收集为第一、三作者。

经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目(81560023)”“2015年度宁夏留学人员科技活动项目”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：实验获得宁夏医科大学总医院科研伦理委员会的审核批准，批准号为2015-105。

知情同意问题：骨骼肌标本来源于宁夏医科大学总医院创伤骨科，脐血标本来源于宁夏医科大学总医院产科，标本收集通过捐献者及家属知情同意。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计学方法已经通过宁夏医科大学统计老师审核。

文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。

开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。

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基金:国家自然科学基金项目(81560023),项目负责人:郑波;2015年度宁夏留学人员科技活动项目,项目负责人:郑波.