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太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光情况分析

2020-12-03 192 上传者：管理员

摘要：试验旨在研究太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光定位，采用细胞免疫荧光技术通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光情况。结果表明：①不同一抗浓度对Lcn5呈现荧光图像影响较大，浓度稀释比例越大，浓度越小，荧光阳性信号越弱，适宜的一抗浓度稀释比为1∶50；不同二抗浓度对Lcn5阳性信号无显著影响，荧光二抗稀释比例为1∶100时荧光更清晰。②激光共聚焦显微镜扫描结果显示，Lcn5在细胞核和细胞质中均有表达；细胞培养到4h时Lcn5在细胞核中大量表达，出现较强的阳性信号，并且在视野下发现培养液中有颗粒状的阳性信号。综上所述,推测Lcn5可能在附睾头细胞培养的过程中在细胞内合成并分泌到细胞外，对附睾微环境的构建起到了作用，同时可能参与精子的成熟过程。

关键词：
Lcn5
免疫荧光
太行山羊
荧光图像
附睾头细胞
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附睾视黄醇结合蛋白（Lcn5）是第一个被报道的附睾特异性表达的Lipocalin蛋白[1]，属于附睾合成和分泌的雄激素依赖性分泌蛋白，分子量18.5kDa。小鼠Lcn5位于2号染色体上，由7个外显子和6个内含子构成[2]。小鼠Lcn5参与机体多种生物功能，能够实现全反式和9-顺式视黄酸的高亲和力结合。也有研究表明，Lcn5在体外结合为全反式而不是9-顺式[3]，参与视黄酸转运，用以维持附睾上皮细胞的完整性，是雄性生殖生理的重要调节因子，并且具有抗炎症反应的功能[4]。最近有研究发现，Lcn5还可增强骨骼肌线粒体功能[5]。Lcn5在机体组织中不同部位均有表达，在雄性生殖器官中表达量较高。也有研究表明，小鼠Lcn5在附睾头部中远端特异性表达[6]，并且在出生后30d起作用[7]。郭丽娜等[8]研究发现，Lcn5在各个组织（前列腺、甲状腺、脾、气管、肾、皱胃、十二指肠、肺、视网膜、膀胱、小脑、肾上腺、胆囊）中均少量表达，在生殖器官中表达量较高。Marchese等[9]的研究结果显示，Lcn5在附睾头部末端表达，在尾部聚集。任有蛇等[10]研究表明，Lcn5在山羊附睾头中的表达量高于附睾尾、附睾体、睾丸，且已证明Lcn5定位于精子顶体前部及尾部中段。张彩霞[11]研究发现，Lcn5在防止精子过早获能中起作用，进一步证实了Lcn5在精子获能中发挥着重要作用。邰苗苗等[12]研究提供了较为成熟的太行山羊附睾头细胞培养方法。但目前Lcn5是否在附睾头细胞中表达定位还未见报道。因此，本研究以体外培养6月龄公山羊附睾头细胞为试验对象，采用细胞免疫荧光技术并利用激光共聚焦显微镜观察Lcn5定位，研究附睾头细胞中Lcn5的具体位置，为进一步明确其在雄性生殖过程中的功能提供理论依据。

1、材料与方法

1.1材料

于2019年11月中旬选取6月龄太行山羊附睾头组织作为培养附睾头细胞的试验材料，试验动物由山西农业大学动物科学学院试验站试验羊场提供。

1.2方法

1.2.1不同一抗浓度筛选（细胞免疫荧光）

把附睾头细胞接种到12孔板上培养24h，弃去培养基，PBS洗3次，每次5min。4%多聚甲醛固定：每孔加500μL4%多聚甲醛37℃固定30min，弃去液体，PBS洗3次，每次5min。每孔加入500μL1%TritonX-100的PBS溶液37℃通透30min，弃去液体，PBS洗3次，每次5min。每孔加入500μL1%BSA(PBS缓冲溶液稀释）37℃封闭1h，弃去液体，PBS洗3次，每次5min。每孔加入200μL一抗（稀释比例分别为1∶50、1∶100、1∶200、1∶500和1∶1000；空白孔加200μLPBS缓冲溶液），4℃过夜。回收一抗，PBS洗3次，每次5min,FITC-羊抗兔IgG荧光二抗避光37℃1h(1∶50稀释）。PBST避光洗3次，每次5min。每孔滴加DAPI原液100μL，避光37℃孵育20min,PBST避光洗4次，每次5min。使用荧光显微镜拍照。

1.2.2不同二抗浓度筛选

参考以往做的一抗浓度，将二抗进行不同比例稀释（分别为1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000），其余步骤同1.2.1。

1.2.3Lcn5蛋白定位

由1.2.1和1.2.2筛选出的一抗和二抗合适浓度进行细胞免疫荧光试验，使用激光共聚焦扫描显微镜进行拍照。

2、结果与分析

2.1不同一抗浓度下山羊附睾头细胞免疫荧光

经荧光染色后，FITC-羊抗兔IgG荧光二抗稀释比为1∶50时，不同一抗浓度下Lcn5在太行山羊附睾头细胞中免疫荧光的结果（见图1）。结果表明，在荧光倒置显微镜下，与阴性对照相比，Lcn5的细胞阳性反应为细胞核和细胞质着色呈黄绿色荧光。从A-3和B-3图中可以看出，视野中的附睾头细胞均呈现出胞核黄绿色，而胞浆中少量黄绿色荧光，说明Lcn5大量表达在细胞核中，少量表达在胞质中。在不同一抗浓度下所拍的照片中，绿色荧光表达量最高的是1∶50，其余依次为1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000，一抗浓度稀释比为1∶500和1∶1000时基本看不到阳性信号；F-1、F-2、F-3图为阴性对照，对照组细胞核内，胞浆内均无阳性信号。

图1不同一抗浓度Lcn5在太行山羊附睾头细胞中的定位（20×）

注：X-1.绿色荧光视野；X-2.DAPI视野；X-3.Merge视野。X=A、B、C、D、E分别代表一抗稀释浓度为1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000,X=F为阴性对照

2.2不同二抗浓度下山羊附睾头细胞免疫荧光

图2为一抗稀释比为1∶100时，不同二抗浓度下Lcn5在太行青山羊附睾头细胞中免疫荧光的结果。结果表明，在荧光倒置显微镜下，与阴性对照相比，Lcn5的细胞胞核着色呈绿色荧光。从图A-3、B-3中可以看出，视野中的附睾头细胞均呈现出胞核绿色，而胞浆有少量黄绿色荧光，说明Lcn5在附睾头细胞的细胞核中大量表达，在胞质中少量表达。在不同二抗浓度下所拍的图片中，A图（1∶50）、B图（1∶100）、C图（1∶200）、D图（1∶500）绿色荧光表达量基本相近；稀释比为1∶1000时的E图片中阳性信号基本看不到，视野与阴性对照无明显区别。图F-1、F-2、F-3为阴性对照，对照组细胞核和胞浆内均无阳性信号。

图2不同二抗浓度Lcn5在太行山羊附睾头细胞中的定位（20×）

注：X-1.绿色荧光视野；X-2.DAPI视野；X-3.Merge视野。X=A、B、C、D、E分别代表二抗稀释浓度为1∶50、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000,X=F：阴性对照

图3激光共聚焦显微镜下Lcn5在太行山羊附睾头细胞中的定位（40×）

注：X-1.绿色荧光视野；X-2.DAPI视野；X-3.Merge视野。X=A.附睾头细胞培养4h;X=B.附睾头细胞培养4h阴性对照；X=C.附睾头细胞培养1h;X=D.附睾头细胞培养1h阴性对照

2.3山羊附睾头细胞免疫荧光

通过比较不同比例一抗、二抗的浓度，最终选取一抗浓度1∶50，二抗浓度为1∶100进行细胞免疫荧光试验并激光共聚焦扫描，结果见图3。附睾头细胞培养1h，细胞刚开始贴壁，此时还未呈现多边形形态，C-3图显示，Lcn5位于细胞核和细胞质中，细胞核中的阳性信号更强；细胞培养4h时，A-1图显示Lcn5蛋白在细胞核和细胞质中的阳性信号明显增强，并且在附睾组织液中也出现了不同程度的阳性信号，阴性对照视野中几乎检测不到阳性信号。与普通荧光显微镜相比，激光共聚焦扫描显微镜的图片更加清晰，阳性信号也更强，荧光视野也更加细致，并且在激光共聚焦显微镜下扫描出的图片中，培养液中也出现了较强的阳性信号。

3、讨论

细胞免疫荧光试验由于抗体效价、来源、研究的对象及该蛋白在细胞中的表达量等不同，需要筛选最佳的一抗浓度。比如，有研究者在试验方法中使用不同一抗稀释比例[13,14]。在相同抗体效价下，阳性信号强弱与一抗浓度有强相关，但浓度过高会引起图片不清晰。另外，为了寻找更佳的二抗浓度使所呈现图片更加清晰，并节省荧光二抗的使用量，设置不同二抗稀释比例的梯度。在本试验中,细胞免疫荧光随着一抗浓度的降低Lcn5阳性信号减弱;激光共聚焦扫描结果显示,使用的一抗和二抗稀释比例分别为1∶50和1∶100时，所拍出的图片视野清晰，阳性信号较强，二抗浓度比说明书推荐的浓度1∶32～1∶64低。因此，在做细胞免疫荧光时，文献中的抗体浓度稀释比例仅供参考。

众多研究表明，Lcn5在雄性生殖器官中表达量较高。Chaurand等[15]利用质谱成像技术首先发现,附睾头中段到附睾尾Lcn5蛋白表达量逐渐增加，并且在附睾尾部聚集。Akmal等[16]在性成熟的大鼠附睾上皮细胞中同样检测到丰富的Lcn5蛋白表达。郭丽娜[8]、Rankin等[17]采用免疫组化法和Lareyre等[18]用原位杂交方法对Lcn5检测也得出了相同的结果。本试验结果显示，Lcn5在附睾头细胞中大量表达，与前人的研究结果一致。Lcn5在附睾头中大量表达提示其可能在附睾头部有着特殊的功能，这也印证了Sophie等[19]对于精子形态结构功能的改变发生在这一部位的推测。蛋白质在附睾不同部位的特殊分布与定量，可能导致精子膜蛋白的成分发生改变，也可能造成精子膜蛋白的糖基化作用方式改变，并最终改变精子的形态、结构和功能，从而影响精子成熟。附睾头细胞对精子成熟影响的机制尚不完全清楚。本研究团队一直以来都在探索附睾中Lcn5对精子成熟、贮存及获能中的作用，并取得了一定的进展。郭丽娜[8]免疫组化结果显示，Lcn5在山羊睾丸和附睾中均有表达，且5月龄之前在山羊附睾头、体、尾和睾丸中的表达水平随着月龄增加而逐渐升高，5月龄达到最高，6月龄表达量开始降低且发生了迁移，从腔外转移到了腔内；进一步研究发现，Lcn5蛋白包裹在精子头部顶体表面，且信号较强，精子颈部及尾部中段也有弱阳性信号。后期张彩霞[11]的试验进一步证实了获能前精子Lcn5定位与郭丽娜[8]报道一致，然而在精子获能后Lcn5随顶体的脱落而消失，初步证明Lcn5具有保护精子顶体完整性和调控精子获能的作用。有研究显示，附睾头细胞分泌到管腔中蛋白在创造有利于精子获得受精能力的微环境中发挥区域特异性作用[20,21]。本试验结果表明，Lcn5在附睾头细胞核、细胞质以及培养液中均有表达，并且在细胞培养过程中，从附睾头细胞培养1h到4h的荧光图片结果显示，Lcn5在细胞生长的这段时间内的分泌量逐渐增多，并且其转移过程为细胞核、细胞质、细胞外（培养液）。根据细胞核出现Lcn5阳性信号，初步推测Lcn5可能参与了附睾中对精子成熟和贮存起到重要作用蛋白质的转录调节。在附睾头细胞培养液中检测到Lcn5阳性信号，说明了分泌蛋白从内质网—高尔基体—囊泡—细胞外的经典分泌途径[22],Lcn5先在细胞内合成，再分泌到细胞外（可能在附睾液中）发挥功能，但还需要进一步试验验证。

4、结论

Lcn5可能在太行山羊附睾头细胞生长的过程中分泌到了附睾组织液中，对附睾微环境的构建起作用，同时可能参与山羊精子成熟过程。

参考文献：

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[10]任有蛇,郭丽娜,张春香,等.山羊Lcn5的表达特点及其在繁殖器官中定位[J].畜牧兽医学报,2015,46(5):711-718.

[11]张彩霞.Lcn5对山羊精子获能和运动能力的影响[D].太谷:山西农业大学,2016.

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[22]欧阳聪.一种新的分泌蛋白Plac9的功能初探[D].武汉:中南民族大学,2018.

董复成,崔岩,任有蛇,张春香.太行山羊附睾头细胞Lcn5免疫荧光定位[J].中国草食动物科学,2020,40(06):1-5.