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不同来源的克拉霉素缓释片工艺降解杂质差异成因

2020-12-03 556 上传者：管理员

摘要：克拉霉素是红霉素的衍生物，为一类大环内酯类抗生素，药理作用机制是通过穿透细胞壁，与核糖蛋白体的50S亚基相结合，从而抑制细菌RND依赖性蛋白质合成而起到药效作用[1,2,3]。20世纪90年代初由日本大正公司开发成功，并以商品名Clarith注册。尔后，大正公司首先将其技术转让给美国雅培公司生产

关键词：
克拉霉素缓释片
工艺
有关物质
药物分析
酸性辅料
降解杂质
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克拉霉素是红霉素的衍生物，为一类大环内酯类抗生素，药理作用机制是通过穿透细胞壁，与核糖蛋白体的50S亚基相结合，从而抑制细菌RND依赖性蛋白质合成而起到药效作用[1,2,3]。20世纪90年代初由日本大正公司开发成功，并以商品名Clarith注册。尔后，大正公司首先将其技术转让给美国雅培公司生产；1990年在爱尔兰、意大利上市，1991年10月获FDA批准定为IB类新药上市，商品名Biaxin,1993年以Klacid在中国香港上市，在欧洲和亚洲的商品名为“克拉仙”。原研制剂企业为美国雅培公司，其固体制剂为克拉霉素片（规格0.25g）和克拉霉素缓释片（规格0.5g），其在国内市场均有进口批件，但克拉霉素缓释片近几年未在国内市场销售。我国于2010年9月首家批准该品种仿制药批准文号，至目前为止，共有6家企业获得克拉霉素缓释片的批准文号。本次试验共收集到国内市场3家企业生产的药品，主要针对克拉霉素缓释片的有关物质进行研究，分析其杂质差异的来源与成因，为同类产品的处方工艺优化和产品研发提供参考。

1、仪器与试药

Agilent1260高效液相色谱仪（安捷伦公司）；AE-163电子天平（梅特勒公司）。

克拉霉素缓释片共50批，分别生产自3家企业（生产企业A共21批次，生产企业B共15批次，生产企业C共14批次），规格均为0.5g。制剂样品及原料药和辅料均来源于国家药品监督管理局国家药品评价性监督抽验项目，涉及国内各个主要省市及地区，分别来源于各生产、经营和使用单位，具有一定的代表性。克拉霉素对照品（批号130558-201303）由中国食品药品检定研究院提供，克拉霉素系统适用性对照品为EP对照品。乙腈为色谱纯，磷酸二氢钾等试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。

2、方法与结果

2.1色谱条件

参照欧洲药典克拉霉素原料药项下有关物质的检查方法[4]。色谱柱：AgilentSB-C18(4.6mm×150mm,3.5μm）；流动相：A为0.035mol·L-1磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾4.76g，加水1000mL使溶解，用稀磷酸或45g·L-1氢氧化钾溶液调pH至4.4),B为乙腈，梯度洗脱（0～32min,25%B→60%B;32～34min,60%B;34～36min,60%B→25%B;36～40min,25%B），后运行5min；流速：1.1mL·min-1；柱温：40℃；检测波长：205nm；进样量：10μL。

2.2系统适用性溶液和对照品溶液的制备

取系统适用性对照品（EP对照品，含11个杂质）约3mg，加稀释剂[水-乙腈（50∶50)]2.0mL使溶解，摇匀，作为系统适用性溶液，其典型色谱图见图1-A。

精密称取克拉霉素对照品约15mg，置200mL量瓶中，加稀释剂[水-乙腈（50∶50）]溶解并定容，摇匀，配制成75μg·mL-1的对照品储备液，注入色谱仪。精密量取75μg·mL-1的对照品储备液2.0mL，置20mL量瓶中，加稀释剂定容配制成7.5μg·mL-1的溶液，作为有关物质对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备

原料药供试品溶液：取各生产厂家原料药约75mg，置50mL量瓶中，加稀释剂[水-乙腈（50∶50）]适量，超声（功率300W，频率40Hz)5min后，放冷，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

图1克拉霉素有关物质典型色谱图

制剂供试品溶液：取克拉霉素缓释片20片，精密称定，计算平均片重，研细后取细粉适量（约相当于克拉霉素75mg），置50mL量瓶中，加稀释剂[水-乙腈（50∶50）]适量，超声（功率300W，频率40Hz)15min后，放冷，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液，其典型色谱图见图1-C。

辅料空白溶液：根据处方量，取空白辅料适量，加稀释剂[水-乙腈（50∶50）]适量，超声（功率300W，频率40Hz)15min后，放冷，并用稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为辅料空白溶液，其典型色谱图见图1-B。

2.4结果

按上述方法进行检测，扣除各企业的辅料空白色谱峰，对50批次制剂供试品溶液的测定结果进行汇总（表1）。除杂质N和杂质K未检出外，其他已知杂质均有检出。按法定方法进行计算，原料和制剂供试品溶液中未知杂质均未检出（检测下限低于0.05%）。其中杂质峰按欧洲药典标准项下方法，以杂质I和杂质H之间的杂质峰进行计算，其他位置的色谱峰均按溶剂峰计。

表1不同来源克拉霉素缓释片杂质含量汇总

由于本次样品均来源于国家药品监督管理局国家药品评价性监督抽验项目，抽取样品均为克拉霉素缓释片，未对其原料药进行抽样。为考察制剂中杂质的来源，对涉及的3家生产企业原料药进行了征集，共收集到每家3批原料药进行测定，并对原料药结果进行了杂质含量的统计，见表2。

表2不同来源克拉霉素原料药杂质含量汇总

2.5杂质差异成因分析

对样品中检出的降解杂质I进行来源分析。分别对克拉霉素原料药进行酸、碱、氧化、光和热破坏，发现其杂质I主要由酸降解所引起。酸降解试验：取克拉霉素原料药约75mg，精密加入1mol·L-1盐酸溶液1.0mL，室温放置5min后用1mol·L-1氢氧化钠溶液中和，用稀释剂定容，摇匀，过滤，取续滤液作为酸降解溶液，进一步确认杂质I是酸降解杂质。

进一步按制剂的生产厂家进行分类，汇总可知，A企业制剂中杂质I平均含量为0.24%,B企业为0.13%,C企业为未检出。三者之间的杂质I含量差异较大。对三者的处方进行分析，发现A和B均有酸性辅料成分，分别为柠檬酸和丙烯酸树脂。为进一步确认酸性辅料对杂质I的影响，考察了制剂pH（取克拉霉素缓释片一片，研细，加水10mL，混匀，测定pH）和杂质I之间的关系。由结果可知，C样品降解杂质基本上均小于0.05%，属于未检出。而A和B的降解杂质相对较高。综合上述分析，可初步确定克拉霉素缓释片降解杂质（即杂质I）主要由制剂工艺过程中加入酸性辅料引起pH的变化所致。建议在研发阶段，关注辅料pH对降解杂质的影响。

酸性辅料的有无直接影响了降解杂质的产生与否，那么在都有酸性辅料存在的情况下，不同的工艺也可能对降解杂质产生影响。比较A和B两者产品的有关物质测定结果可知，A产品的杂质I含量呈现不同批次其含量差异较大，结果表明：同作为有酸性辅料存在的2个产品，B的平均值为0.13%,A的平均值为0.24%，同时A的杂质I分布离散性远大于B，见图2。

图2不同来源克拉霉素缓释片杂质I含量离散图

对这2家的处方工艺进一步深入分析。A企业的工艺：取原料药（API）与其他辅料过筛混匀，加入乙醇、丙烯酸树脂适量，制软材，制粒，烘干，整粒，加入硬脂酸镁，压片包衣；B企业的工艺：将API、柠檬酸、其他辅料混匀后，制软材，过筛，制粒，烘干，过整粒，加入硬脂酸镁，压片包衣。A企业样品杂质I分布的离散性可能基于2个原因：（1）不同批次间产品的pH存在差异，或随着时间贮藏时间的长短，而导致杂质I的变化。（2）工艺原因。基于上述原因的分析调查，对A样品每批的pH进行测定，结果很稳定，基本均为4.3左右，认为其不同批次间的pH稳定。同时对同一生产企业不同批次的样品中杂质I含量结果进行分析，亦未发现杂质I随贮藏时间的增加而增加，故初步排除了第1个原因。进一步比较A、B2家企业的工艺，发现A样品酸性辅料在制软材时加入，此时克拉霉素原料药为软粒状态，加入酸性辅料在混匀制粒过程中可能会导致局部酸性过强，具有一定程度上的偶然性。因此，不同批次的杂质I含量分布表现更为离散；而B企业样品的制剂工艺过程中，酸性辅料和原料均在完全固态下就进行充分混合均匀，原料与酸性辅料的相互反应作用力（即降解杂质I的产生）较软粒状态下要弱，其在完全混合均匀的状态下再进行制软材的工艺操作，因此，其杂质I含量的分布形式更为集中，且平均含量值更低。

3、讨论

对各个法定质量标准进行比对，发现《中华人民共和国药典》[5]、美国药典[6]、日本药典[7]及各个注册标准[8,9,10]等使用等度洗脱方法，流动相体系为磷酸盐缓冲盐和甲醇或乙腈，各个色谱条件均不能有效地将主峰前后的各个杂质分离，且分离出的杂质个数明显少于梯度洗脱方法。欧洲药典克拉霉素方法采用0.035mol·L-1磷酸盐缓冲液-乙腈流动相体系，梯度洗脱，检测波长为205nm，其对杂质的分离度与灵敏度均好于上述方法，故综合比较后采用欧洲药典的方法对克拉霉素缓释片的有关物质进行测定。

大环内酯类抗生素的组分通常比较复杂，已有多个关于克拉霉素杂质测定方法的研究[11,12,13,14]。通过对克拉霉素合成途径的认识和已知杂质化学结构[15,16]，总结了克拉霉素中可能存在的杂质，并按来源大致可分为3个方面：（1）起始原料红霉素A中引入的杂质，包括杂质A、B、D、H、M。（2）克拉霉素合成过程中引入的中间体和副产物，包括杂质C、E、F、G、J、L、O、P。故上述工艺杂质均为原料工艺杂质。（3）降解产物，包括杂质I、K、N，其中杂质K和N均未在所有样品中检出：克拉霉素在酸性条件时不稳定，易于脱去3位克拉定糖生成克拉霉素杂质I，杂质I进一步降解生成克拉霉素杂质K。其余潜在的杂质包括克拉霉素杂质N。

由于原研制剂在国内未有销售，故仅考察了原研生产企业在国内的原料药杂质情况，其杂质总量与国内原料药未见明显区别。综上所述，对国内市场上的克拉霉素缓释片样品进行了杂质情况的考察，并对其杂质来源及成因进行了初步的分析。药用辅料对药物的吸收具有重要的影响，并且在药物制剂过程中往往存在原料与辅料相容性的问题[17,18]。实验结果表明，不同来源的克拉霉素缓释片其杂质主要来源于原料药中的工艺杂质，其含量基本一致。少量的降解杂质主要由制剂过程所引起，不同的处方工艺对其降解杂质的形成和含量有不同程度的影响，建议研发生产企业重视原料药的杂质属性，优化处方工艺，关注酸性辅料对降解杂质的影响，在保证人体生物利用度与原研制剂相一致的基础上，尽量降低杂质含量。

参考文献：

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