脂肪组织在与年龄相关的代谢功能障碍和衰老方面起着关键作用[1,2]。一项调查研究显示，在60岁以上的老年人中，有37%是肥胖的[3]。老年性肥胖与许多慢性病有关，同时肥胖又加速了这些与年龄相关疾病的发生、发展。脂肪细胞的发育、分化可以引起代谢综合征，即胰岛素抵抗、糖尿病、脂质代谢紊乱和高血压等疾病，罹患动脉粥样硬化的风险显著升高[4,5]。因此，探究脂肪细胞分化的分子机制具有十分重要意义。

近年来，脂肪组织成为人们关注的焦点，通过释放多种生物活性物质及各种脂肪因子来调控细胞内信号通路，其中一个关键点是脂肪酸结合蛋白4(fattyacid-bindingproteins4,FABP4)，也称之为脂肪细胞蛋白2(Adipocyteprotein2,aP2)，在脂肪组织中高表达，作为脂质伴侣蛋白，对于维持脂肪细胞稳态、调节脂肪细胞生成及分解有重要作用[6]。miRNA为小非编码RNA，控制多种基因表达，在肥胖及其他代谢综合征中，特别在脂肪细胞分化和增殖过程中扮演重要角色[7]。LI等[8]研究发现，miR-26b可靶向抑制PTEN的表达，通过激活PI3K信号通路，增加葡萄糖摄取能力，促进3T3-L1前脂肪细胞分化。关于miR-26b是否通过PTEN-PI3K/AKT通路调节细胞内FABP4水平，进而影响脂肪细胞分化及细胞内脂质积累尚未见公开报道。作者推测miR-26b及FABP4在前脂肪细胞分化过程中发挥重要作用，通过抑制miR-26b表达调控PTEN-PI3K-AKT通路进而抑制FABP4表达，最终实现抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化，为临床脂质相关疾病治疗提供一个新的思路。

1、材料和方法

1.1 设计

体外细胞模型，细胞功能数据采用单因素方差分析。

1.2 时间及地点

实验于2015年7月至2016年3月在内蒙古医科大学分子病理实验室完成。

1.3 材料

3T3-L1小鼠脂肪前体细胞购于中科院上海细胞库。K2转染系统(德国Biontex公司)；PTEN、AKT、FABP4、PI3K、Tubilin抗体(ProteintechGroup公司)；荧光二抗(CellSignaling公司)；miR-26b、PTEN、FABP4、PI3K、AKT、GAPDH引物(天根生化科技(北京)有限公司)；miR-26binhibitor(上海吉玛制药技术有限公司)；Westernblot红外荧光扫描系统(美国CLX公司)；ABI7500Fast荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 3T3-L1细胞培养及诱导分化

用含体积分数为10%胎牛血清、100U/mL青、链霉素的DMEM培养基(标准培养基)，在37℃，体积分数为5%CO2条件下培养3T3-L1细胞。

诱导分化：待细胞长满至80%-90%，接触抑制(是指细胞在培养瓶中贴壁生长，长到相互接触时停止繁殖的现象)2d后，换成含有IBMX、胰岛素和地塞米松的高糖、高脂DMEM培养基培养48h，再更换为含胰岛素的高糖、高脂DMEM培养基培养48h，最后更换为标准培养基继续培养6d,3T3-L1细胞可被诱导分化为成熟脂肪细胞。

1.4.2 3T3-L1细胞转染miR-26binhibitor

将3T3-L1细胞接种于6孔板，每孔接种约4.5×105个细胞，加入标准培养基培养过夜，每孔加入12μLK2Multiplier培养2h，用130μLDMEM培养基分别稀释miR-26binhibitor质粒DNA2.4μg/孔和K2TransfectionRegent6.4μL/孔，混合后室温下孵育15min，将混合液加入6孔板培养24h，更换为标准培养基继续培养48h。miR-26binhibitor质粒载体带有报告基因绿色荧光蛋白，转染成功后可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。

1.4.3 实验分组

取3T3-L1细胞分为4组：对照组(3T3-L1细胞)、分化组(分化成熟的3T3-L1细胞)、转染组(转染miR-26binhibitor的3T3-L1细胞)、转染分化组(转染miR-26binhibitor的3T3-L1细胞再诱导分化成熟)。

1.5 主要观察指标

1.5.1 油红O染色观察成熟脂肪细胞内脂滴

取分化组和转染分化组细胞，吸弃培养基，加入5mL体积分数为10%中性甲醛固定30min，加入5mL油红O染液室温下染色10min，用体积分数为75%乙醇漂洗染料，显微镜下观察可见成熟脂肪细胞内脂滴染为红色。

1.5.2 荧光定量PCR方法检测细胞内miR-26b的相对表达

取接种于6孔板的4组细胞，分别按照天根生化科技(北京)有限公司的miRcutemiRNA提取分离试剂盒说明书提取细胞内总miRNA，按照miRcutemiRNAcDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA，反转录条件37℃反应60min。miR-26b上游引物序列为5’-UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU-3’，下游引物由试剂盒提供。按引物说明书分别配制浓度为10μmol/L的工作液，按照miRcutemiRNA荧光定量检测试剂盒说明书在冰上配置反应体系。将配制好的反应体系移入八连管，每管反应总体积为20μL，放入PCR仪，按说明设定反应程序。使用PCR仪自带软件进行数据分析，实验重复3次，每次每组设置3个复孔，结果按照2-∆∆Ct法计算出各组miR-26b相对表达量。

1.5.3 RT-PCR方法检测细胞内FABP4、PTEN、PI3K、AKTmRNA的相对表达

取接种于6孔板的4组细胞，按以下方法提取细胞内总mRNA：弃培养基，每孔加入1mLTrizol，室温放置2min后转移至离心管中，加入氯仿200μL，振荡15min，室温静置15min,4℃、12000r/min离心2min，吸取上层液体，加入等体积异丙醇，混匀后室温静置5min,4℃、12000r/min离心5min，沉淀中加入体积分数为75%乙醇1mL，振荡15min,4℃、12000r/min离心5min，管内沉淀静置干燥5min，加入50μLDEPC水溶解。取总mRNA溶液，按照天根生化科技(北京)有限公司的FastQuantRTKit(WithgDNase)试剂盒说明书合成cDNA，引物序列见表1。按引物说明书分别配制浓度为10μmol/L工作液，按照天根生化科技(北京)有限公司SuperRealPreMixPlus(SYBRGreen)试剂盒说明书在冰上配置反应体系，将配制好的反应体系移入八连管，每管反应总体积为20μL，放入PCR仪，按说明设定反应程序。使用PCR仪自带软件进行数据分析，实验重复3次，每次每组设置3个复孔，结果按照2-∆∆Ct法计算出各组mRNA相对表达量。

1.5.4 Westernblot法检测细胞内FABP4、PTEN、PI3K、AKT蛋白的表达

取接种于6孔板的4组细胞，弃培养基，每孔加入100μLRIPA裂解液，在冰上裂解30min,4℃、12000r/min离心5min,BCA法检测样本中蛋白的含量，将各组提取蛋白分别加入含有溴酚蓝的上样缓冲液按4∶1混合，沸水中煮5min，按每泳道30μg蛋白加入上样孔，80V电泳1h,160V电泳至溴酚蓝接近分离胶底部，135mA电流转至NC膜1.5h，将FABP4、PTEN、PI3K、AKT以及内参Tubilin一抗按照1∶1000稀释，4℃孵育过夜。将荧光二抗按照1∶5000稀释，室温下孵育2h，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min，放入ODESSY荧光红外扫描系统中检测蛋白条带的灰度值，计算蛋白的相对表达量。实验重复3次，结果取平均值。目的蛋白的相对表达量=目的蛋白灰度值/内参Tubilin灰度值。

1.6 统计学分析

采用SPSS13.0统计软件进行结果统计，数据以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步进行组间比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 光学显微镜、荧光显微镜观察细胞形态

对照组3T3-L1细胞形态呈梭形或多角形，见图1A；转染组普通显微镜下观察3T3-L1细胞形态无明显变化，见图1B；分化组成熟脂肪细胞形态为椭圆形或圆形，细胞体积明显变大，细胞内可见大小不等的脂滴，将细胞核推向细胞的一侧，见图1C；转染分化组仅见少量细胞分化变为圆形，体积较成熟脂肪细胞小，细胞内可见少量细小脂滴，罕见大脂滴，油红O着色较浅，见图1D。转染组荧光显微镜下可见50%-60%细胞内表达绿色荧光蛋白，见图1E，证明质粒已转入细胞内并稳定表达。

2.2 荧光定量PCR检测细胞内miR-26b表达水平

分化组miR-26b表达较对照组升高了5.4倍(P<0.05)，转染组miR-26b水平是对照组的0.43倍(P<0.01)，提示miR-26b在3T3-L1细胞分化过程中明显升高，转染miR-26binhibitor可以明显抑制细胞内miR-26b表达，见图2。

2.3 荧光定量PCR检测细胞中FABP4、PI3K、AKT、PTENmRNA表达水平

与对照组比较，分化组、转染分化组FABP4、PI3K、AKTmRNA表达明显增加(P均<0.01)，转染组则明显减少(P均<0.01)。与分化组比较，转染分化组细胞内FABP4、PI3K、AKTmRNA表达量相对减少(P均<0.01)。FABP4、PI3K、AKTmRNA表达在3T3-L1细胞正常分化过程中明显升高，但抑制miR-26b表达可以降低3T3-L1细胞内FABP4、PI3K、AKTmRNA表达水平，同时进一步降低了分化后细胞内FABP4、PI3K、AKTmRNA表达水平，从而降低了细胞的分化能力，见图3。

与对照组比较，分化组、转染组、转染分化组PTENmRNA表达均明显增加(P均<0.01)。与分化组比较，转染分化组细胞内PTENmRNA表达量相对增高(P<0.05)。PTENmRNA表达在3T3-L1细胞正常分化过程中明显升高，抑制miR-26b表达可以升高3T3-L1细胞内PTENmRNA表达水平，同时分化后细胞内PTENmRNA表达水平进一步升高，从而降低了细胞的分化能力，见图3。

2.4 Westernblot检测细胞中FABP4、PI3K、AKT、PTEN蛋白表达水平

与对照组比较，分化组FABP4、PI3K、AKT蛋白表达明显增加(P均<0.01)，提示3T3-L1细胞正常分化过程中PI3K-AKT-FABP4通路激活。与对照组比较，转染组FABP4蛋白表达明显下降(P<0.01),PI3K、AKT蛋白表达有下降趋势，但差异无显著性意义(P均>0.05)。与分化组比较，转染分化组细胞内FABP4、PI3K、AKT蛋白表达均明显减少(P均<0.01)。抑制miR-26b表达可以降低3T3-L1细胞内FABP4蛋白表达水平，对PI3K、AKT蛋白表达影响不明显，但分化后细胞内FABP4、PI3K、AKT蛋白表达水平明显降低，提示抑制miR-26b表达可以降低分化过程中细胞内PI3K-AKT-FABP4通路活性，见表2。

与对照组比较，分化组PTEN蛋白无明显变化(P>0.05)，转染组PTEN蛋白表达明显下降(P<0.01)，转染分化组则明显升高(P<0.01)。与分化组比较，转染分化组PTEN蛋白表达明显升高(P<0.01)。PTEN蛋白在正常细胞分化中无明显变化，在抑制miR-26b表达后细胞内PTEN蛋白有所下降，但抑制后再分化时细胞内PTEN蛋白表达明显升高，见表2。

3、讨论

肥胖或者体内脂肪过度堆积现已成为一个全球性健康问题，它已成为一些慢性疾病的高危因素，比如2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病、高血压、癌症等[9,10,11]。分子水平调节脂肪组织动态平衡机制是了解肥胖和代谢功能障碍发病的关键。研究表明miRNA在脂肪细胞分化和脂肪代谢等与肥胖有关的生物过程中扮演着重要的调控角色[12,13]。尽管如此，影响体内脂肪细胞大小、数量的基因以及途径目前仍不清楚。该实验探讨抑制miR-26b对前脂肪细胞分化的影响，为脂肪细胞分化的调控机制提供一个新的思路。

FABP4在脂肪细胞内高度表达，作为一种新的脂肪因子，其mRNA及蛋白表达在脂肪细胞分化中发挥重要作用[14,15,16]。在细胞分化过程中，FABP4表达明显增加，并已被作为脂肪细胞分化的标志物[17,18]。FABP4与多种疾病相关，如肥胖、代谢综合征、2型糖尿病和胰岛素抵抗等[19,20,21]。MicroRNA作为小的调节分子，参与脂肪细胞的增殖分化，与肥胖等疾病密切相关[22,23]。XU等[24]研究证实miR-26b在前脂肪细胞分化过程中明显增多，过表达miR-26b促进前脂肪细胞分化，增加了细胞内脂质的积累，表明miR-26b在前脂肪细胞分化过程有重要作用。该实验结果显示，与对照组比较，分化组内FABP4及miR-26b表达明显增多，二者是否存在一定的相互作用关系，进而调节前脂肪细胞的分化，还需要进一步研究。

PI3K/AKT通路是细胞内重要的信号通路，参与调节糖、脂肪代谢。在胰岛素刺激下，IRS-1可与p85亚基结合，进而激活PI3K，通过一系列过程磷酸化形成p-AKT，促进糖原合成、减弱脂肪分解等向细胞膜转位，促进细胞对葡萄糖的摄取，最终调节糖、脂肪代谢[25]。PTEN具有磷酸酶活性，它可负性调控PI3K/AKT通路[26]。ZHANG等[27]研究发现，miR-26b通过直接靶向作用PTEN，激活NF-κB途径增强炎症反应。XU等[28]研究发现，miR-26b过表达明显降低脂肪细胞中PTEN水平，激活PI3K通路，实现对前脂肪细胞分化及葡萄糖摄取的调节。MAKOWSKI等[29]发现FABP4会增加胆固醇酯并诱导泡沫细胞形成，通过激活IKK-NF-κB途径引起炎症反应。DONG等[30]研究中指出，BMS-309403通过靶向抑制FABP4表达可明显降低体质量和血清葡萄糖浓度，同时增加血清胰岛素浓度，推断FABP4可能成为妊娠期糖尿病治疗靶点。

FABP4及miR-26b是否在3T3-L1细胞分化过程中存在着某种联系，并且通过某种信号通路实现3T3-L1细胞分化的调控，为该研究埋下了伏笔。油红O染色后在光学显微镜下观察细胞内的脂滴，与分化组比较，转染分化组分化为圆形的细胞少，体积小，细胞内见小脂滴，油红O着色较浅，提示抑制细胞内miR-26b水平，可以抑制3T3-L1细胞向脂肪细胞分化，减少细胞内脂滴积累。RT-PCR及Westernblot实验显示，与对照组比较，分化组PI3K、AKT、FABP4mRNA及蛋白表达明显增加，PTENmRNA表达虽然增加，但蛋白水平无明显变化，提示3T3-L1细胞分化过程中PI3K-AKT通路激活，FABP4水平升高。作为PI3K-AKT通路的负性调控蛋白，PTENmRNA水平升高但蛋白水平未见明显变化，推测可能存在其他调控因素调控PTEN蛋白表达而实现动态平衡。与分化组比较，转染分化组细胞内FABP4、PI3K、AKTmRNA及蛋白表达减少，PTENmRNA及蛋白表达增高，提示抑制miR-26b明显促进PTENmRNA及蛋白表达，从而抑制PI3K-AKT通路，降低FABP4mRNA及蛋白表达，进而抑制3T3-L1细胞分化。

综上所述，抑制miR-26b可以调控细胞内PTEN-PI3K-AKT通路，降低FABP4的表达，从而抑制了3T3-L1细胞的分化，为3T3-L1细胞分化的调控提供一种新的分子证据，但miR-26b、PTEN-PI3K-AKT通路及FABP4三者是否存在直接或间接的调节与被调节关系，将是进一步研究方向。

参考文献:

[26]迟毓婧,李晶,管又飞,等.PI3K-AKt信号传导通路对糖代谢的调控作用[J].中国生物化学与分子生物学报,2010.26(10);879-885.

文章来源：娜日松,孙亮,赵振群,梁戎,王鑫.miR-26b调控脂肪酸结合蛋白4介导脂肪细胞分化的分子机制[J].中国组织工程研究,2022,26(02):260-265.