环状RNA(circRNA)是一类非编码的RNA分子，分为外显子来源的circRNA、内含子来源的circRNA、由外显子和内含子共同组成的circRNA,其中外显子来源的circRNA广泛存在于细胞质中[1,2]。与正常组织相比，结肠癌、胃癌和食管癌等肿瘤组织中部分circRNA表达存在明显差异，并与肿瘤转移和临床分期等相关，提示circRNA可能参与肿瘤的发生、发展过程[3]。circRNA在成肌细胞的增殖和分化中发挥重要作用，但具体机制尚不明确[4]。成肌细胞是骨骼肌的前体细胞，具有较强的增殖和分化能力，体外培养的C2C12细胞可在低血清诱导条件下分化为多核的肌管，并表达肌细胞生成素(myogenin,MYOG)和肌球蛋白链(myosinheavychain,MHC)等成熟骨骼肌的标志蛋白。本研究分析circZfp609在小鼠成肌细胞系C2C12细胞增殖和分化过程中的作用，以期为骨骼肌增殖或分化异常疾病的临床诊断和治疗提供新靶点，报道如下。

1、材料与方法

1.1 一般材料

小鼠成肌细胞系C2C12细胞(ATCCCRL-1772)购自美国模式菌种收集中心。小鼠成肌细胞C2C12在DMEM培养基(含体积分数15%胎牛血清)中进行常规传代培养，取对数生长期细胞进行增殖实验。诱导C2C12细胞分化时采用DMEM分化培养基(含体积分数2%马血清)中培养。增殖期与分化期细胞均于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

DMEM培养基(美国Gibco公司),Trizol试剂(美国Sigma公司),TaqDNA聚合酶、反转录试剂盒、ChamQSYBRColorqPCRmastermix荧光定量试剂盒(南京诺维赞公司),siRNA(广州锐博生物科技有限公司),LipofectamineRNAiMAX、HRP标记羊抗鼠IgG二抗、免疫荧光标记羊抗鼠IgG二抗、iBrightFL1000ECL显影仪(美国Invitrogen公司),核质分离试剂盒(美国ThermoFisher公司),CCK-8试剂盒(美国MCE公司),鼠源MYOG蛋白、鼠源MHC蛋白(美国SantaCruz公司),鼠源GAPDH(美国CST公司)。荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司),激光扫描共聚焦显微镜(德国CarlZeiss公司)。

1.2.2 分组方法

采用LipofectamineRNAiMAX试剂盒，按照说明书转染体外培养的C2C12细胞。特异性沉默circZfp609的siRNA设计为接口处序列，其序列为5'-GTCTGAAAAGCAATGATGT-3'。特异性沉默Zfp609的siRNA设计序列为5'-GAGTACCAACACCGCTTAT-3'。增殖期与分化期C2C12细胞分别分为circZfp609敲低组、Zfp609敲低组和对照组，分别转染特异性敲低circZfp609的siRNA、特异性敲低Zfp609的siRNA和对照siRNA。

1.2.3 增殖期C2C12细胞circZfp609和其线性mRNA相对表达量检测及增殖期与分化期C2C12细胞circZfp609核质分布情况

收集增殖期与分化期C2C12细胞，采用核质分离试剂盒回收其细胞质和细胞核的成分，提取RNA,将所提取RNA分别反转录成cDNA,采用实时荧光定量PCR法分别检测细胞质和细胞核circZfp609表达情况。收集增殖期C2C12细胞，采用Trizol提取细胞总RNA,反转录成cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测circZfp609和其线性mRNA相对表达量。按照ThermoScientific公司反转录试剂盒操作流程进行操作，引物序列见表1。反应体系：共10μL,包括上、下游引物各0.2μL,cDNA1μL,ddH2O3.6μL,2×qPCR预混液5μL。反应条件：95℃3min;95℃15s,58℃30s,72℃30s,40个循环。以GAPDH为内参基因，分析C2C12细胞质circZfp609及Zfp609mRNA表达情况；以U6为内参基因，分析C2C12细胞核circZfp609表达情况；采用2-△△Ct法对目的基因相对表达量进行分析。比较增殖期C2C12细胞circZfp609敲低组与对照组、Zfp609敲低组与对照组circZfp609、Zfp609mRNA相对表达量，分析不同时期C2C12细胞circZfp609核质分布情况。

1.2.4 增殖期C2C12细胞增殖情况检测

采用CCK-8法。转染48h后，分别将3组增殖期C2C12细胞接种于96孔板，接种密度为2×105个/mL,每孔加入CCK-8试剂10μL,37℃细胞培养箱孵育1h。应用多功能M200PRO酶标仪测定波长450nm处的吸光度值间接反映细胞的增殖情况，观察培养前及培养第1、2、3、4天C2C12细胞增殖情况。细胞增殖率=(敲低组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。比较增殖期C2C12细胞circZfp609敲低组与对照组、Zfp609敲低组与对照组的细胞增殖率。

1.2.5 分化期C2C12细胞MHC和MYOG蛋白表达情况

采用免疫荧光染色法。3组分化期C2C12细胞分别以3×104/孔的密度接种，转染24h后，于分化第2、4天采用体积分数4%多聚甲醛固定细胞，加入一抗鼠抗鼠MYOG(1:50)、MHC(1:50),4℃过夜，1×PBS清洗3次后加入荧光标记羊抗鼠IgG二抗(1:400)及DAPI混合液，淬灭剂封片，应用激光扫描共聚焦显微镜(ZeissLSM710)观察其表达情况。观察分化期C2C12细胞circZfp609敲低组与对照组、Zfp609敲低组与对照组MHC和MYOG蛋白表达情况。

1.2.6 分化期C2C12细胞MHC和MYOG蛋白相对表达量检测

采用Westernblot法。3组分化期细胞分别以7.5×104/孔的密度接种于6孔板，转染24h后，于分化第2、4天收集总蛋白。RIPA裂解30min,BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，加入一抗鼠抗鼠MYOG(1:200)、MHC(1:200)和GAPDH(1:1000),4℃过夜，1×TBST清洗3次后加入HRP标记羊抗鼠IgG二抗(1:1000),发光液孵育15min,用X胶片曝光显影，胶片进行图片扫描，应用ImageJ软件进行分析。MHC、MYOG蛋白相对表达量以灰度值表示。比较分化期C2C12细胞circZfp609敲低组与对照组、Zfp609敲低组与对照组MHC和MYOG蛋白相对表达量。

1.3 统计学处理

应用SPSS18.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示，2组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 circZfp609的表达及不同时期核质分布情况

以C2C12细胞的cDNA为模板，PCR检测可见其表达条带(290bp)与预测一致。核质分离后，实时荧光定量PCR检测结果显示circZfp609在增殖期C2C12细胞质中占52.75%,细胞核中占47.25%;在分化期C2C12细胞质中占71.38%,细胞核中占28.62%。见图1。

2.2 circZfp609敲低组、Zfp609敲低组与对照组circZfp609及Zfp609

mRNA相对表达量比较增殖期C2C12细胞circZfp609敲低组circZfp609相对表达量(0.124±0.008)低于对照组(1.000±0.064)(t=59.262,P<0.001),Zfp609mRNA相对表达量(1.269±0.173)与对照组(1.000±0.052)比较差异无统计学意义(t=2.533,P=0.131)。Zfp609敲低组circZfp609相对表达量(1.063±0.138)与对照组(1.000±0.159)比较差异无统计学意义(t=0.931,P=0.442),Zfp609mRNA相对表达量(0.580±0.062)低于对照组(1.000±0.121)(t=12.936,P=0.007)。

2.3 circZfp609敲低组、Zfp609敲低组与对照组细胞增殖率比较

增殖期C2C12细胞培养第1～4天，circZfp609敲低组细胞增殖率逐渐下降；circZfp609敲低组第1、2天细胞增殖率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),第3、4天时细胞增殖率均低于对照组(P<0.05)。细胞培养第1～4天，Zfp609敲低组细胞增殖率先升高后降低；Zfp609敲低组第1、4天细胞增殖率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),第2、3天细胞增殖率均高于对照组(P<0.05)。见表2-3。

2.4 circZfp609敲低组、Zfp609敲低组与对照组MYOG、MHC蛋白表达情况比较

免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，分化期C2C12细胞circZfp609敲低组MYOG、MHC蛋白表达呈不同程度增加，细胞纤维长度增长，极化明显，出现明显的细胞融合；Zfp609敲低组MYOG和MHC蛋白表达均呈不同程度降低，细胞纤维长度缩短，极化不明显，细胞融合减少。见图2。

2.5 circZfp609敲低组、Zfp609敲低组与对照组细胞MYOG和MHC蛋白相对表达量比较

分化期C2C12细胞circZfp609敲低组MYOG、MHC蛋白相对表达量均高于对照组(P<0.05),Zfp609敲低组MYOG、MHC蛋白相对表达量均低于对照组(P<0.05)。见图3,表4-5。

3、讨论

circRNA是广泛存在于各种生命体细胞中的RNA分子，具有稳定性高、保守、表达组织特异性等特征[5,6]。研究[7,8,9,10]表明，circRNA表达在神经系统疾病和肿瘤的发生、发展中起重要作用。有文献[11]报道，非编码RNA如lncRNA、miRNA、circRNA在成肌细胞的增殖、分化过程中参与了多种调节机制，miR-22通过干扰靶基因TGFBR1的表达来调节C2C12细胞的增殖和分化。Legnini等[12]研究表明，circ-ZNF609可翻译成小分子多肽，进而促进成肌细胞的增殖。

circZfp609主要是由Zfp609mRNA的第2外显子反向剪接形成，由290个碱基组成，circZfp609的成环接口处的碱基为G-C。circZfp609在人和鼠中均有表达，尤其是在神经系统、肌肉组织中呈高表达，其在增殖期和分化期的表达有明显差异[13]。MHC和MYOG在诱导分化后的肌管中呈阳性表达，表明该骨骼肌卫星细胞具有融合为肌管的能力。本研究结果显示，增殖期circZfp609敲低组细胞培养第3、4天时细胞增殖率均低于对照组，分化期circZfp609敲低组细胞MYOG、MHC蛋白相对表达量高于对照组；与对照组比较，分化期circZfp609敲低组细胞MYOG、MHC蛋白表达增强，细胞纤维长度增长，极化明显，出现细胞融合；说明C2C12细胞增殖期干扰circZfp609的表达，可抑制其增殖；C2C12细胞分化期干扰circZfp609表达，可促进MYOG和MHC表达，形态学上表现为肌细胞纤维长度增长，出现更明显的细胞融合和极化。提示circZfp609参与了C2C12细胞的增殖和分化过程，但具体机制尚未完全明确。

circRNA最常见的功能是作为miRNA海绵体与miRNA结合，影响miRNA对基因的调控。除作为miRNA及蛋白海绵体，circRNA还可作为支架蛋白促进酶的共定位、结合转录因子抑制靶基因表达、参与亲本基因表达调控、在特定情况下还可翻译出多肽。本研究结果显示，增殖期circZfp609敲低组circZfp609相对表达量低于对照组，Zfp609mRNA相对表达量与对照组比较差异无统计学意义；Zfp609敲低组circZfp609相对表达量与对照组比较差异无统计学意义，Zfp609mRNA相对表达量低于对照组；说明敲低circZfp609的表达并不影响其亲本基因Zfp609的表达，而敲低Zfp609的表达也不影响circZfp609的表达，提示其干扰序列的特异性，推测这2种RNA虽然从同一基因序列产生，但二者转录和后续加工过程是相对独立的事件。

此外，根据circRNA参与的功能不同，circRNA所处的细胞定位也不同，如作为miRNA或蛋白海绵体时，circRNA需由细胞核运输到细胞质起作用，而参与亲本基因表达调控或结合转录因子抑制靶基因时，circRNA常在细胞核中起作用。本研究核质分离结果显示，circZfp609在增殖期C2C12细胞质中占52.75%,在分化期细胞质中占71.38%,提示circZfp609可能是作为miRNA海绵体参与C2C12的分化过程。本研究结果显示，增殖期C2C12细胞培养第1～4天，Zfp609敲低组细胞增殖率先升高后降低，至第4天时细胞增殖率与对照组比较差异无统计学意义；分化期Zfp609敲低组细胞MYOG、MHC蛋白相对表达量均低于对照组；说明敲减Zfp609并未明显改变C2C12细胞的增殖情况，但可抑制其分化过程。Zfp609作为一个锌指蛋白，目前发现可与RNA聚合酶Ⅱ相互作用直接调控下游基因表达，并在皮质神经元迁移中发挥作用[14]。提示Zfp609也可与不同分子伴侣结合，进一步选择调控下游成肌分化相关基因，但有待结合位点分析等实验的验证。

本研究结果提示，circZfp609参与小鼠成肌细胞系C2C12细胞的增殖和分化过程，但本研究并未发现circZfp609的具体分子作用机制，后续研究中可通过生物信息学预测可结合的miRNA,进一步验证其miRNA的表达，同时预测目标miRNA可结合的靶基因，归纳circRNA-miRNA-mRNA轴，为进一步分析circZfp609参与C2C12细胞的增殖和分化的具体机制提供分子基础，最终为骨骼肌细胞增殖及分化异常的疾病提供诊断与治疗的新靶标。

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文章来源：黎满慧,王海霞,张伟,方征宇.circZfp609在小鼠成肌细胞系C2C12细胞中表达及意义[J].中华实用诊断与治疗杂志,2021,35(12):1246-1250.