产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,Cp）属于梭菌属，是一种厌氧、革兰氏阳性的芽胞大杆菌[1]，早在1960年该菌株就被分为A至E五种血清型，目前最新毒素分型方案又将产气荚膜梭菌分为7个型，在A至E上增加了F和G两种[2-3]。产气荚膜梭菌广泛存在于自然环境和动物肠道中[4]，临床上可引起多种动物患病，包括气性坏疽、肠毒血症、坏死性肠炎等症状[5]，其中A型产气荚膜梭菌是所有菌株中危害较严重的毒素型菌[6]。

A型和C型菌株是导致仔猪腹泻的主要菌株，临床上主要引起仔猪红痢，特征为坏死性或出血性肠炎。A型可导致非出血性的严重腹泻，C型主要特征是出血性腹泻[7]。2022年我国部分地区产气荚膜梭菌流行病学调查显示，哺乳仔猪产气荚膜梭菌阳性率为22.73%，分离到的31株产气荚膜梭菌均为A型菌株[8]。越来越多的新生仔猪肠炎被诊断为A型产气荚膜梭菌引起的肠炎，并且A型产气荚膜梭菌感染会引起大量的死亡[9-10]。乳酸菌（Lactic Acid Bacteria,LAB）属于革兰氏阳性菌，主要以球菌和杆菌两种形式存在[11]。早在上世纪90年代，乳酸菌就已开始被作为表达外源基因的良好载体，可作口服疫苗和黏膜免疫的载体菌株，它具有易于培养、稳定、基因修饰简便、可以直接口服等优势[12]。果糖1,6-二磷酸醛缩酶（Fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba）属于一种代谢酶，也称为二磷酸果糖酶，在糖异生和糖酵解过程中起到至关重要的作用，研究发现Fba存在于许多原生动物、植物、细菌和真菌中[13-15]。Fba主要分为两类，即Fba-Ⅰ和Fba-Ⅱ，Fba-Ⅰ主要出现在动物、植物和藻类等高等真核生物中，以四聚体的形式出现；Fba-Ⅱ主要存在于低等真核生物细胞内，结构上呈同源的二聚体结构[16-17]。Fba基因全长为870 bp左右，由大约290个氨基酸组成[18]，近年来大量研究发现Fba对多种动物疾病具有良好的免疫原性，不同菌属之间具有高度保守性，可作为诸多动物疾病的候选抗原，研制出高效广谱的疫苗制剂[19]。

研究以分离得到的A型产气荚膜梭菌提取全基因组DNA为模板，获取目的基因Fba，进行大肠杆菌原核表达载体的构建，将Fba蛋白纯化后制备多克隆抗体，随后该基因被连接到乳酸菌穿梭表达载体pLA上，成功构建出A型产气荚膜梭菌重组干酪乳杆菌，该重组菌表达的蛋白和抗血清具有良好的反应原性。

1、材料与方法

1.1 材料

干酪乳杆菌（CICC 6105）购自中国工业微生物菌种保藏中心，由实验室保存于-80℃环境下；A型产气荚膜梭菌由实验分离鉴定后成功保存；革兰氏阳性菌全基因组提取试剂盒来自Solarbio公司；pET-28a、pLA（带有pgsa锚定蛋白）载体由实验室保存；胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础（TSC）、疱肉培养基购自青岛海博生物技术有限公司；限制性核酸内切酶BamHⅠ、SaIⅠ、T4 DNA连接酶、10×T4DNA Ligase Buffer以及PCR试剂等均购自TaKaRa公司；DH5α、BL21感受态细胞购自唯地生物有限公司；1.5 mmol·L-1Tris-HCI、1 mmol·L-1Tris-HCI购自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank公布的Fba基因序列（CP000246.1:1777354-1778220）设计引物，引物由生工生物工程长春（股份）有限公司合成，引物信息如表1所示。

表1 引物设计

Table 1 Primer design

1.2.2 Fba基因获取与扩增

将保存于-80℃的A型产气荚膜梭菌划线于胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸固体培养基上，置于37℃培养箱厌氧培养12 h，挑取单个菌落培养于疱肉培养基肉汤（实验室配置）中培养12 h后取1 m L菌液，根据Solarbio革兰氏阳性菌全基因组DNA提取试剂盒提取A型产气荚膜梭菌全基因组DNA，以提取的DNA为模板，25μL PCR体系扩增Fba基因，PCR反应条件：94℃变性5 min,52℃退火45 s,72℃延伸1 min，共30个循环。

1.2.3 A型产气荚膜梭菌Fba重组大肠杆菌的构建及鉴定

将PCR产物回收后与载体pET-28a同时进行双酶切（BamHⅠ、SalⅠ），将双酶切后的Fba基因和载体pET-28a回收后置于16℃培养箱中连接16 h，将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，经PCR及双酶切鉴定正确后，送生工生物工程上海（股份）有限公司进行测序，将鉴定正确的重组菌命名为pET-28a-Fba。

表2 免疫程序

1.2.4 重组p ET-28a-Fba大肠杆菌蛋白表达纯化与多克隆抗体制备

将重组pET-28a-Fba大肠杆菌转化至BL21，以1.0 mmol·L-1的IPTG诱导6 h后进行SDS-PAGE分析，发现上清和沉淀中均有蛋白表达。上清采用NI NTA Beads 6FF蛋白纯化预装柱进行纯化，沉淀蛋白纯化参照杨雨晴等[20]利用尿素梯度法复性后采用Ni-NTA agaose方法进行纯化，多克隆抗体参照李超等[21]制备。

1.2.5 重组p ET-28a-Fba大肠杆菌表达Fba蛋白的Western blot鉴定

以1.0 mmol·L-1IPTG诱导表达蛋白，选取最佳时间的表达菌，取1 m L菌离心弃上清后加入上样缓冲液沸水煮10 min进行Western blot。

1.2.6 重组质粒pLA-Fba的构建及鉴定

将pET-28a-Fba及pLA空载体用BamHⅠ、SaIⅠ进行双酶切后，回收目的片段Fba和pLA。随后将胶回收的Fba片段和pLA载体片段进行连接，转化至DH5α感受态细胞，将鉴定正确的重组质粒命名为pLA-Fba。

1.2.7 重组质粒pLA-Fba的电转化

pLA-Fba重组质粒感受态细胞及电转化参考王巧慧等[22]的干酪乳杆菌电转化方法，将干酪乳杆菌6105划线培养后，挑取单个菌落接种于无抗性MRS液体培养基中，将菌液培养至OD600为0.5左右，进行干酪乳杆菌感受态制备，将制备好的感受态细胞200μL与1μL重组质粒pLA-Fba转移至电击杯中，在电转仪中进行电转，加入750μL MRS培养基（含10%蔗糖）在电击杯中，将其全部吸入1.5 m L离心管中，37℃恒温培养箱厌氧静置培养3 h，离心收集菌体后涂布于氯霉素抗性（34μg·m L-1）的MRS平板上，次日挑取单菌落在MRS液体培养基中进行培养。

1.2.8 重组干酪乳杆菌pLA-Fba/L.casei的鉴定

重组菌质粒提取采用索莱宝革兰氏阳性菌质粒提取试剂盒，以提取的重组质粒pLA-Fba为模板对Fba基因进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行分析。

1.2.9 重组干酪乳杆菌的Western blot鉴定

将培养10 h的pLA-Fba/L.casei用溶菌酶在37℃环境下处理，30 min后离心，与上样缓冲液混合后，在沸水中煮10 min后离心，随后进行Western Blot鉴定。

1.2.1 0 外源蛋白在重组干酪乳杆菌pLA-Fba/L.casei表面的定位检测

间接免疫荧光检测：取培养8 h的重组菌洗涤3次，经200目筛网过滤后取20μL均匀涂布于载玻片上，待其干燥后置于无水乙醇中固定，固定后置于5%脱脂乳中封闭，随后进行阳性血清（1∶100孵育8 h）和二抗（FITC标记的羊抗鼠IgG二抗1;100孵育3 h）孵育，每次孵育完毕用PBST洗涤3次，最后晾干置于荧光显微镜下镜检。

流式细胞术检测：将重组菌洗涤3次后调整重组菌浓度为5×106个·m L-1,5%脱脂乳封闭后同间接免疫荧光试验一样孵育抗体，最后经流式细胞仪检测。

2、结果

2.1 Fba基因的获取

成功扩增出Fba基因，结果见图1，可见870 bp的目的基因Fba片段。

图1 Fba基因获取

2.2 重组菌pET-28a-Fba/E.coli构建

重组菌菌落PCR成功扩增出Fba基因，结果见图2 A；重组质粒p ET-28a-Fba用BamHⅠ和SaIⅠ双酶切后可看到870 bp的Fba基因片段和5 369 bp的pET-28a载体条带（图2B）。

图2 重组菌p ET-28a-Fba/E.coli构建的琼脂糖凝胶电泳鉴定

2.3 重组大肠杆菌p ET-28a-Fba/E.coli的蛋白表达及Western blot鉴定

以1.0 mmol·L-1的IPTG诱导6 h后进行SDS-PAGE分析，每小时取1次样，发现5 h时蛋白表达效果最佳。

图3 不同时间Fba蛋白诱导的SDS-PAGE

随后以1.0 mmol·L-1的IPTG诱导5 h后的重组菌进行蛋白纯化，纯化结果如图3 A，蛋白大小为31 k Da，与预期结果一致。将纯化的蛋白免疫兔子后制备多克隆抗体，以制备的A型产气荚膜梭菌Fba蛋白多克隆抗体作为一抗，对Fba蛋白进行Western lot鉴定（图4B），结果表明，制备的抗体能够与表达的蛋白结合，具有较好的反应原性。

图4 Fba蛋白纯化分析

图5 重组质粒p LA-Fba鉴定

2.4 pLA-Fba/E.coli的鉴定

从pLA-Fba/E.coli提取重组质粒pLA-Fba，进行PCR扩增，结果显示了大小约为870 bp片段，与预期结果一致，用BamHⅠ和SaIⅠ对PCR鉴定正确的重组质粒pLA-Fba进行酶切处理，结果酶切出大小为6 342 bp的载体片段及870 bp的目的基因Fba片段。表明成功构建了pLA-Fba/E.coli。

2.5 重组pLA-Fba/L.casei的鉴定结果

免疫荧光鉴定显示，pLA-Fba/L.casei在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光反应，而对照组并未见到绿色荧光，结果如图6所示。

用溶菌酶处理pLA-Fba/L.casei进行Western blot鉴定，pLA-Fba/L.casei在约63 kDa处出现条带（图7A）。随后将鉴定正确的重组菌进行流式细胞术鉴定，鉴定结果显示，表达的阳性菌高达92.35%。

图6 pLA-Fba/L.casei间接免疫荧光鉴定结果

图7 pLA-Fba/L.casei Western Blot及流式细胞术鉴定

3、讨论

虽然A型产气荚膜梭菌主要的毒力因子和保护性抗原是α毒素，但是产生的β2毒素、Net B毒素和肠毒素也同样具有致病性[23-24]，所以选取一个能够预防多种毒素的保护性抗原对产气荚膜梭菌非常重要，预防产气荚膜梭菌感染的主要方法是注射疫苗，目前国内外采用产气荚膜梭菌类毒素疫苗或灭活疫苗来预防该病[25]，利用其产生的各种毒素制备出行之有效的类毒素疫苗，但是这些疫苗需要经过注射免疫，而乳酸菌可通过影响体液免疫系统、细胞免疫系统和肠道黏膜免疫系统等免疫应答过程调节机体的免疫功能[26]。

Fba在生物体内的代谢作用中起到不可或缺的作用，目前越来越多的研究表明，Fba在动物细菌、寄生虫，水产动物等方面具有很好的应用价值[27-28]，通过生物信息学分析、分子生物学实验、免疫学实验验证该蛋白具有良好的免疫原性及黏附作用[29-30],Fba已成为支原体、细菌性疾病、动物寄生虫性疾病的研究重点[31]，所以研究Fba对A型产气荚膜梭菌以及动物疾病的作用机制，对于目前动物疫苗、广谱性疫苗研发具有重要意义。

为了获取A型产气荚膜梭菌Fba蛋白及多克隆抗体，通过构建p ET-28a-Fba/E.coli重组菌，利用NI NTA Beads 6FF蛋白纯化预装柱成功获取重组蛋白Fba，并将该蛋白与弗氏佐剂混合后免疫兔子，3次免疫后采取兔子血液获Fba多克隆抗体，抗体与Fba蛋白具有良好的反应原性，说明成功制备Fba多克隆抗体，该抗体可用于后续实验。构建pLA-Fba/L.casei并且Western blot检测结果显示重组的干酪乳杆菌表达的蛋白与抗血清具有良好的反应原性；间接免疫荧光、流式细胞仪检测结果表明目的蛋白能够展示表达到菌体表面，成功构建A型产气荚膜梭菌Fba重组干酪乳杆菌，对A型产气荚膜梭菌口服疫苗的研发奠定基础。

4、结论

成功提取A型产气荚膜梭菌全基因组DNA并获取目的基因Fba，成功构建pET-28a-Fba/E.coli和pLA-Fba/L.casei，并表达出A型产气荚膜梭菌Fba蛋白，免疫兔子后获取阳性血清，其阳性血清与重组菌表达的蛋白具有很好的反应原性。

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基金资助:“三纵”科研团队(自然)TDJH201904动物肠道菌群与免疫学研究创新团队;

文章来源:杨启尧,范佳霖,秦达,等.A型产气荚膜梭菌Fba重组干酪乳杆菌的构建与表达[J].黑龙江八一农垦大学学报,2024,36(06):36-42+71.