近几年来,大规模的银杏和杜仲经济林栽培项目已经启动,中国的银杏叶产量大约每年有4万吨,杜仲叶的产量也在3万吨以上。如何将这些林产资源有效利用,成为实际生产中需要解决的问题。我国农村农业部公告第194号:自2020年1月1日起,畜禽类饲料全面禁抗,人们将视角转向可饲用天然产物饲料添加剂的开发。银杏叶、杜仲叶作为林产资源天然产物,它们除具有一般树叶的营养外,还富含黄酮类化合物、绿原酸、萜内酯、聚戊烯醇等生物活性物质。微生物在植物资源发酵过程中起到分解转化作用,在营养价值及生物活性方面,经过发酵的银杏叶饲料添加剂均有大幅度的提高[1]。幼龄仔鸡的免疫系统尚未发育成熟,机能不健全,对环境应激因素易感,益生素正逐渐成为增强禽类生产性能、改善肠道健康和功能的重要途径[2]。预期通过营养调控措施进行肠道健康的管理越来越受到专家学者的认可。多项研究表明,使用银杏叶、杜仲叶及其提取物作为禽畜及水产动物的饲料添加剂,能减少预防用药,增加食用安全性[3]。国内外关于复合发酵银杏-杜仲叶作为饲料添加剂对肉鸡生长发育的研究报道尚比较缺乏[4]。

本研究采用产阮假丝酵母和黑曲霉菌复合发酵按一定比例复配的杜仲叶和银杏叶,同时提升总黄酮和绿原酸等活性成分的含量,制备出一种生物饲料添加剂,选用AA肉鸡作为研究对象,探讨外源添加银杏-杜仲叶混合发酵物(简称“FGE”)对肉鸡的生长发育、肠道结构与消化功能的作用,以期为银杏叶和杜仲叶作为饲料添加剂在家禽饲料中的使用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1试验材料

1.1.1原料

银杏叶:南京林业大学银杏园,10月树上采摘,自然晾晒叶;杜仲叶:河南理工大学杜仲园,12月落叶收集,自然晾晒叶。以上材料均60℃烘干后、粉碎机磨成粉,40目过筛,装入自封袋密封保存。

菌种:产朊假丝酵母(Candidautilis)和黑曲霉(Aspergikrsniger)均来自南京林业大学化学工程学院微生物菌种保藏室。于土豆葡萄糖斜面培养基(PDA)上保存。

固体培养基:以银杏-杜仲叶为主要发酵原料80%;适量添加麸皮,添加量为20%,含2.0%葡萄糖、3.0%(NH4)2SO4、2.0%KH2PO4、0.5%MgSO4·7H2O。水分含量60%。

所有培养基都需在121℃条件下灭菌30min。在优化试验过程中,培养基的组成会有所变化。

1.1.2试验动物

360只1日龄健康AA肉仔鸡(购自山东烟台苏佳丽禽业有限公司),体重平均为(49.24±3.89)g,差异不显著(P>0.05)。

1.2试验设计

1.2.1发酵试验设计

单因素试验:采用250mL锥形瓶作发酵容器,固体重量50g,厚度1～2cm,加60%的水,灭菌后接种产朊假丝酵母量1.0%(按培养基的干重比例配)。

银杏-杜仲叶发酵选择常规条件:银杏叶与杜仲叶配比为2∶1,黑曲霉菌为2.0%(按培养基的干重比例配),发酵温度为28℃,发酵时间为96h。选取银杏叶与杜仲叶配比1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1,黑曲霉菌0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,发酵温度为23、25、28、30、32℃,发酵时间为48、72、84、96、120h作为工艺参数探讨值,进行单因素试验。在单因素试验基础上进行四因素三水平L9(34)正交试验。每个处理做3个重复,每个重复做3次平行试验,取平均值。

1.2.2动物试验设计

在确定最佳的银杏叶与杜仲叶配比和最佳发酵工艺条件后,选用1日龄(1d)健康、体重相近的AA肉仔鸡360只(公鸡苗,P>0.05),完全随机设计分为6个处理组,每个处理组含6个重复(每个重复10只鸡)。分为:基础日粮对照组;未发酵银杏-杜仲叶(NFGE组),分别在基础日粮中添加NFGE前期0.3%,后期0.6%;4个FGE组(FGE1、FGE2、FGE3、FGE4),即在基础日粮中添加FGE前期分别为0.2%、0.3%、0.4%和0.5%,后期分别为0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。

试验期42d,分别在试验的第1、21、42天的早晨07:00空腹称重并结料,逐只将试鸡进行称重。称重前1d的晚上7:00断料,但持续喂水,计算以重复为单位进行,记录不同生长阶段鸡的采食量、体增重及料重比(F/G)。试验基础日粮采用玉米-豆粕型,其组成及营养水平见表1。日粮分前期(0～21d)和后期(21～42d)2个阶段,在不同的日粮处理组中,采用重量替代法配制,使用麸皮来补齐试验添加物的量。

表1基础日粮组成及营养水平

1.3采样与测定方法

1.3.1提取方法

称取干燥发酵产物5.0g,在超声波功率500W条件下,固液比1∶15、乙醇浓度70%、提取温度为50℃条件下,提取20min,累计提取2次,合并提取液。

1.3.2样品的采集与制备

每个处理于每个重复中随机抓取1只鸡,颈静脉采血制备血清,置-20℃冰箱待测,颈部放血致死。取新鲜的十二指肠、空肠、回肠组织,于每段组织截取1cm左右的肠段,轻轻用生理盐水冲洗掉肠道食糜,放入4%甲醛溶液中固定,备用于形态检测分析分离胰腺、十二指肠、空肠和回肠,均要轻轻挤出肠道各段的食糜,再分别将各段肠管剪开,先轻轻用载玻片刮去各肠段表层的残留食糜,再用适度刮取黏膜,将黏膜分别于-70℃的冰箱保存,备用。

1.3.3活性成分测定

总黄酮浓度测定:以芦丁为对照品制备溶液,505nm波长制定标准曲线,获得回归方程:A=11.1556C+0.0061,R2=0.9997。适用浓度0～48.0mg/L。

绿原酸浓度的测定:以绿原酸为对照品制备溶液,328nm波长制定标准曲线,获得回归方程:C=19.0490A-0.0744,R2=0.9984。适用浓度0～38.4mg/L。

总黄酮、绿原酸含量计算方法:分别在505nm、328nm下测定其吸光值,代入相应回归方程,计算总黄酮、绿原酸浓度C1、C2,计算提取率Y1、Y2。

计算公式为:Y=100%C×N×V/m。式中:Y:发酵物总黄酮或绿原酸提取率;C:样液中总黄酮或绿原酸浓度,mg/L;N:稀释倍数;V:提取液体积,L;m:原料质量,mg。

1.3.4蛋白质和氨基酸含量的测定

采用凯氏定氮法测定复合发酵物中粗蛋白含量(GB/T14771-93)。发酵物样品用6mol/L的HCl在110℃水解22h后测总氨基酸含量,用HP-1050型液相色谱仪进行测定[5]。

1.3.5肠道形态结构与酶活性的测定

肠道形态采用对肠道切片进行HE染色,采集图像,分析获得。测定酶活性试剂盒购自南京建成生物工程研究所,按说明操作。

1个淀粉酶活力单位为:37℃条件下,每克组织或食糜或每毫克蛋白与底物作用,30min,每水解10mg淀粉,定义为1个淀粉酶活力单位。

1个脂肪酶活力单位为:每克组织及食糜(或每毫克蛋白)37℃下,于反应体系中和底物反应1min,每消耗lμmol底物,定义为1个脂肪酶活力单位。

1个总蛋白酶单位为:在40℃和pH=6.0条件下,每克组织及食糜或每毫克蛋白每分钟水解酪素产生1μL酪氨酸,定义为1个总蛋白酶活力单位。

1.3.6小肠黏膜碱性磷酸酶(AKP)活性的测定

采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定十二指肠、空肠和回肠黏膜中AKP活性。组织匀浆上清液中蛋白质含量采用文献[6]方法进行测定。

1.3.7血清D-木糖浓度和血清尿素氮的测定

均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定血清D-木糖浓度和血清尿素氮,按说明操作。

1.3.8统计分析

采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析(One-wayANOVA);以IBMSPSSStatistics19.0软件采用独立样本t检验进行统计分析,差异显著性水平设为P<0.05;采用Duncan氏多重比较法进行显著性检验,差异显著性水平设为P<0.05(或P<0.01)。数据采用“平均值±标准差”表示。

2、结果与分析

2.1银杏-杜仲叶发酵工艺参数研究

2.1.1银杏与杜仲叶配比对总黄酮和绿原酸含量的影响

如图1,随着银杏叶质量比重的增加,总黄酮含量有明显增加(P<0.05),绿原酸含量有所降低,在比例2∶1开始,绿原酸含量降低明显。随着杜仲叶比例的增加,绿原酸含量增加明显(P<0.05),总黄酮含量呈降低趋势,总黄酮和绿原酸总含量出现先增加后降低的情况。综合考虑,正交试验银杏叶与杜仲叶配比为1∶1、2∶1、3∶1。

图1银杏叶与杜仲叶配比对总黄酮和绿原酸含量的影响

同指标相比,不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.1.2黑曲霉菌接种量对总黄酮和绿原酸含量的影响

如图2,随着黑曲霉菌接种量的增加,总黄酮和绿原酸的含量均出现明显提升趋势(P<0.05),当接种量达到2.0%时,总黄酮量增势减缓。综合考虑,正交试验黑曲霉菌接种量设计为1.5%、2.0%、2.5%。

2.1.3发酵温度对总黄酮和绿原酸含量的影响

如图3,随着发酵温度的升高,总黄酮和绿原酸的含量呈先升后降,根据变化趋势,正交试验发酵温度设计为25、28、30℃。

2.1.4发酵时间对总黄酮和绿原酸含量的影响

如图4,随着发酵时间的延长,总黄酮和绿原酸的含量均有明显提升,总黄酮含量出现明显下降,综合考虑,正交试验发酵时间设计为72、84、96h。

图2黑曲霉菌接种量对总黄酮和绿原酸含量的影响

图3发酵温度对总黄酮和绿原酸含量的影响

图4发酵时间对总黄酮和绿原酸含量的影响

2.1.5银杏-杜仲叶复合发酵工艺条件优化

根据单因素试验的结果,确定银杏叶与杜仲叶的质量比例(A)、黑曲霉菌接种量(B)、发酵温度(C)、发酵时间(D)为试验因素,如表2来设计正交试验因素水平,优化银杏-杜仲叶复合植物资源发酵工艺结果如表3。

表2银杏-杜仲叶复合发酵工艺正交试验因素水平

表3银杏-杜仲叶复合发酵工艺正交试验结果

注:同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。

表3数据所示,4个因素对总黄酮提取率和绿原酸含量影响均有显著性差异,对总黄酮含量影响力依次为A>C>D>B,总黄酮含量最高的工艺组合为A3B2C1D2;对绿原酸提取率影响力依次为A>C>D>B,绿原酸含量最高的工艺组合为A1B2C2D2。分析单因素试验趋势和正交试验结果,取A2B2C2D3和A2B2C3D3进行最优化工艺参数比较确定试验,结果显示总黄酮和绿原酸的含量分别为2.13%、0.50%和2.12%、0.43%。最终选定A2B2C2D3为最佳工艺条件,此条件下固态发酵产品总黄酮含量为2.13%,绿原酸的含量为0.50%。

2.1.6银杏-杜仲叶发酵产物的主要营养成分及活性成分分析

对选定条件下银杏-杜仲叶发酵产品中主要营养成分和生物活性成分进行分析,经t检验分析如表4,发酵后相对应发酵前各项主要营养成分和活性成分均有显著提高(P<0.05)。粗蛋白的含量从发酵前的12.41%增加到25.23%,提高了103.30%;总氨基酸、必需氨基酸含量分别从发酵前的9.76%和3.74%增加到17.49%和6.34%,分别提高了79.20%和69.52%;总黄酮含量发酵前的1.67%增加到2.13%,提高了27.55%;绿原酸含量由发酵前的0.42%增加到0.50%,提高了19.48%。

表4银杏-杜仲叶发酵产物主要营养成分及活性成分分析

注:肩标*表示与发酵前对应值差异显著(P<0.05)。

2.2动物试验

2.2.1FGE对肉鸡生产性能的影响

由表5可知,在1～21d的生长发育阶段中,各组间的日增重和日采食量均无显著差异(P>0.05),22～42d和1～42d的日增重无显著差异(P>0.05);FGE2和FGE3组22～42d的日采食量与对照组相比显著降低(P<0.05);F/G在1～21d各FGE组间无显著差异(P>0.05),但与对照组和NFGE组相比,FGE2和FGE3组的F/G在22～42d和1～42d间有显著降低(P<0.05)。

表5日粮添加FGE对肉鸡生长性能的影响

注:同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

2.2.2FGE对肉鸡小肠绒毛形态的影响

由表6可见,与对照组相比,日粮中添加FGE显著增加了肉鸡十二指肠绒毛高度(P<0.05)。与对照组和NFGE组相比,FGE3和FGE4组的空肠绒毛高度显著增加(P<0.05),FGE2、FGE3、FGE4组空肠的隐窝深度显著降低(P<0.05)。就回肠而言,与对照组和NFGE组相比,日粮中添加FGE显著降低了肉鸡回肠隐窝深度(P<0.05),显著提高了绒毛高度与隐窝深度之比(P<0.05)。此外,总体而言,日粮中添加FGE对十二指肠绒毛高度,空肠绒毛高度及隐窝深度产生了线性和二次线性影响。

表6FGE对肉鸡小肠形态及发育的影响

2.2.3FGE对肉鸡消化酶活性的影响

与对照组相比,FGE2、FGE3和FGE4组的肉鸡胰腺蛋白酶活性有显著升高(P<0.05)(表7)。与对照组相比,FGE3和FGE4组十二指肠和空肠蛋白酶活性、十二指肠淀粉酶活性有显著提高(P<0.05);日粮中添加FGE显著增加了空肠淀粉酶的活性(P<0.05)。分析结果表明,随着日粮中FGE添加水平的增加,对胰腺和十二指肠的蛋白酶活性有线性(P=0.036,P=0.040)影响。

表7FGE对肉鸡胰腺和小肠内容物消化酶活性的影响

2.2.4FGE对肉鸡AKP酶活性的影响

由图5可见,与对照组和NFGE组相比,FGE2、FGE3组肉鸡十二指肠AKP的活性显著提高(P<0.05);此外,与对照组相比,FGE3和FGE4组的空肠AKP活性也有显著提高(P<0.05)。

2.2.5FGE对肉鸡血清D-木糖和尿素氮水平的影响

如图6所示,与对照组和NFGE组相比,日粮中添加银杏叶发酵物对血清D-木糖水平均有提高,其中FGE2、FGE3组差异显著(P<0.05)。添加FGE显著降低血清尿素氮水平(P<0.05)。分析结果表明,随着日粮中FGE添加水平的增加对血清D-木糖水平有线性(P=0.013)影响。

图5日粮添加FGE对肉鸡小肠黏膜AKP活性的影响

相同指标,不同字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同

图6FGE对肉鸡血清D-木糖和尿素氮水平的影响

3、讨论

3.1双菌发酵对银杏叶-杜仲叶固态发酵的影响

本试验采用了黑曲霉菌和产朊假丝酵母菌,混合发酵银杏叶、杜仲叶原料,使其粗蛋白、氨基酸、总黄酮类和绿原酸含量皆得到提高,这和汤小朋[7]在研究单菌及混菌固态发酵木薯渣品质中认为混菌发酵能够较好提高产品蛋白质含量的结论是一致的。双菌发酵可以解除单菌发酵时微生物产生代谢产物累积导致的反馈遏制,如本研究中黑曲霉会产生大量的纤维素酶,分解纤维素产生大量还原糖,这些还原糖除了供应黑曲霉自身利用外,大部分将积累在培养基,从而阻遏黑曲霉继续分泌纤维素酶[8];而产朊假丝酵母菌恰恰可以利用这些还原糖,从而使发酵持续进行,直至发酵更为彻底,而且还产生了大量的菌体蛋白[9]。这也可以解释本研究中无论是单叶发酵还是复合叶发酵,最终产品的蛋白含量都有大幅提高。

3.2发酵温度和时间对银杏叶-杜仲叶固态发酵的影响

固态发酵过程中,微生物生长会有大量的热产生,引起物料温度变化,需要有效控制发酵温度。发酵时间也是影响发酵品质的重要因素,发酵过程中,产物浓度随着发酵时间而变化。本试验中银杏叶的发酵温度为28℃、发酵时间为72h,杜仲叶的发酵温度为30℃、发酵时间为96h,银杏-杜仲叶混合发酵的温度为28℃、时间为96h。和赵林果等[1]以银杏叶为原料,采用黑曲霉为发酵菌种,生产饲料复合酶的研究:发酵温度是28-30℃,发酵时间72h的条件相近,低于陈旸等[10]采用植物乳杆菌发酵转化人参皂苷发酵温度35℃发酵温度。低于侯衍英等[11]以红曲霉双向固态发酵丹参20d的发酵时间。这和微生物的种类和具体发酵基质相关。

3.3FGE对肉鸡生产性能的影响

植物资源经过微生物发酵处理,发酵产物中富含各种酶、维生素和生长因子[12],发酵后银杏黄酮甙元能够更容易、更迅速地被动物的肠道消化吸收[13]。本研究中,AA肉鸡日粮中添加发酵产物FGE显著改善了F/G,原因可能是日粮中添加银杏-杜仲叶发酵物改善了肉鸡肠道的健康状态,进而降低了肉鸡的脂肪沉积。腹部沉积的脂肪作为家禽产业和家禽市场的一种浪费,被认为是一种额外的损失,本试验揭示了日粮中添加FGE能够降低腹部脂肪的沉积,进而改善了动物的饲料效率。

3.4FGE对肉鸡消化机能的影响

肠道是最重要的营养吸收位点,肠道黏膜的结构能够在一定程度上反应肠道健康与否。食糜中存在的应激因子与黏膜表面近距离接触,能够快速改变肠道黏膜的结构。本试验中,与对照组相比,饲喂FGE组肉鸡的十二指肠和空肠的绒毛高度,空肠的绒毛高度与隐窝深度之比都有显著增加。本试验中所观察到的生产性能的改善与肠道结构的改善是相吻合的。

在肠道中,随着肠细胞的成熟并上移至绒毛顶端,AKP酶活性的表达增加。因此,AKP活性的增加表明肠道中较多数量的官能的和成熟的肠上皮细胞[14]。本试验中,发酵物处理肉鸡的AKP活性比对照组显著提高,这可能暗示了银杏-杜仲叶发酵物具有通过刺激AKP的活性而改善机体消化和吸收功能的能力。日粮中添加FGE对AKP活性的刺激作用也支持本试验中生产性能的结果。

胰腺及肠道消化酶在肠道大分子的消化与吸收中起着关键的作用。本试验中肠道蛋白酶和淀粉酶的活性增加与尿素氮分泌降低的结果相一致。Hong等[15]报道大分子的肽,如抗原蛋白,可能会被降解为小分子的肽。同时,抗营养因子-酶复合物的减少可能也会为营养物质的消化让出更多的消化酶[16],最终导致对饲料更高效率的利用并改善肉鸡的F/G。因此,肉鸡日粮中添加FGE对肠道消化酶活性的改善作用可能与FGE中的蛋白质对酶的降解作用有关。

4、结论

银杏-杜仲叶复合发酵的最佳工艺参数:初始含水量60%,培养基初始pH为5.0,接种产朊假丝酵母菌量为1.00%,银杏叶与杜仲叶配比为2∶1,黑曲霉菌接种量为2.00%,发酵温度为28℃,发酵时间为96h,培养基通过生物转化后营养丰富,总黄酮和绿原酸含量达到最优化,分别为2.13%和0.50%,比发酵前分别提高了27.55%和19.48%。发酵后蛋白含量提高103.30%,必需氨基酸含量提高69.52%。日粮中添加0.2%～0.5%(后期0.4%～1.0%)的FGE,能够改善肠道结构,增强肠道消化吸收功能,明显降低料重比,从而提升肉鸡的生长性能。

参考文献：

[1]赵林果,李同军,唐莹,等.利用银杏叶制备酵母饲料添加剂的优良菌筛选及其培养条件[J].林产化学与工业,2007,27(3):37-41.

[2]肖文权.中草药和益生素对番鸭的生产性能与保健功效的研究[D].福州:福建农林大学,2014.

[3]姚红梅,肖克宇,钟蕾.杜仲在养殖业中的应用[J].养殖与饲料,2005(2):17-19.

[5]许彦芳,许新民,王永利.高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量[J].河北医科大学学报,1996(3):7-9.

[7]汤小朋.单菌及混菌固态发酵改善木薯渣品质的研究[D].成都:四川农业大学,2014.

[10]陈旸,王义,孙亮,等.植物乳杆菌发酵转化人参皂苷的研究[J].中国中药杂志,2014,39(8):1435-1440.

[11]侯衍英,刘文忠,李存能,等.红曲霉-丹参双向固态发酵工艺条件优化[J].化学与生物工程,2018,35(9):61-65.

曹银娣,张旭晖,孙智远,汪贵斌,曹福亮.银杏-杜仲叶复合发酵工艺优化及发酵物对肉鸡肠道功能的影响[J].畜牧与兽医,2020,52(06):27-34.

基金:国家重点研发计划项目(2017YFD0600701)